심비디움과 팔레놉시스에서 아그로박테리움과 유전자총을 이용한 형질전환 효율 비교 Comparison of Transformation Efficiency by using Agrobacterium and Particle Bombardment in Cymbidium and Phalaenopsis
pp.199-205
심비디움과 팔레놉시스의 형질전환 효율이 본 연구에서 비교되었 는데, 이를 위해 선발유전자로 PPT(Phosphinothricin) 제초제 저항 성인 bar 유전자가 사용되었고, 도입된 노화지연 유전자인ORE 7은 잎과 꽃에서 노화를 지연시켜 주며, 또한 개화 수를 늘려주는 형질 전환 식물체 개발에 이용될 것이다. 형질전환 방법 비교실험에서 심 비디움과 팔레놉시스 모두 아그로박테리움 방법이 유전자총 방법보 다 높은 효율을 보여 주었다. 또한 전반적으로 심비디움의 형질전환 효율이 팔레놉시스의 효율보다 높았음이 관찰되었다. 아그로박테리움 접종 전에 유전자총으로 미리 물리적 상처를 주어 접종효율은 높여 궁극적으로 형질전환 효율을 높이고자 수행한 실험에서는 오히려 무 처리구보다 더 낮은 형질전환 효율을 관찰하였다. 아그로박테리움 감 염 전 건조처리를 통한 형질전환 효율향상 실험에서는 심비디움의 경우 45분이 20%의 형질전환 효율로서 효율이 10% 미만인 대조 구보다 우수하였고, 팔레놉시스는 60분 건조처리가 가장 우수하였다. 형질전환 개체들의 PCR 분석을 통해 노화지연유전자ORE7이 도입 되었음을 확인하였고, real-time PCR 검정을 통해 도입된 형질전 환 유전자 copies를 확인하였다. 그결과, 전체 24개의 분석된 형질 전환 개체 중 심비디움 15개체 중 8 개체가 1 copy를 가지고 있 었고 나머지 7 개체는 2-3 copies를 가지고 있었다. 팔레놉시스는 오직 1개체만 1 copy 였고, 나머지 8개체는 2 copies 이상의 유 전자가 도입되었다. 본 연구에서 개선된 형질전환 체계는 앞으로 심 비디움과 팔레놉시스 형질전환 체계를 효과적으로 확립하는데 응용 될 것이라 판단된다.
Transformation efficiencies (T.E.) of Agrobacterium and particle bombardment in Cymbidium and Phalaenopsis were compared in this study. For this, pCAMBIA3301:ORE7 vector which carries a herbicide-resistant bar gene and ORE7 gene as a target trait was employed for transformation experiments in Cymbidium and Phalaenopsis. This ORE7 gene can be used for the production of transgenic orchid plants with delaying senescence in leaf and flowers and also for increasing the number of flowers in the future. Agrobacterium-mediated transformation showed higher T.E. than that of particle bombardment in both Cymbidium and Phalaenopsis plants. Also, T.E. in Cymbidium was higher than that of Phalaenopsis. However, physical shock by particle bombardment prior to Agrobacterium infection showed quite low T.E. compared to typical Agrobacterium infection without pre-treatment by particle bombardment. Regarding effect of drying treatment before Agrobacterium infection on T.E. in orchid, 45 min of drying treatment showed the best result with almost 20% of T.E in Cymbidium as compared of less than 10% of T.E. in control. In Phalaenopsis, 60 min of drying period prior to Agrobacterium infection showed 1.3 times better than control. PCR analysis with transgenic plants showed ORE7 target gene was introduced precisely. Twenty-four transgenic orchid plants which consist of 15 transgenic Cymbidium and 9 Phalaenopsis plants were selected for real-time PCR analysis to detect the expression of ORE7 gene and to determine number of copies of transgene in transgenic plants. As a result, 8 of 15 transgenic Cymbidium plants had 1 copy of transgene and other 7 transgenic plants had more than 2 copies of transgene. However, only one transgenic Phalaenopsis plant had one copy of transgene among 9 transgenic Phalaenopsis plants. We concluded that optimized transformation systems here can be applied for the development of well-established transformation system in Cymbidium and Phalaenopsis in the future.