Although fenarimol is a widely used chlorinated fungicide applied to fruits and vegetables and considered as a suspected endocrine disrupter (ED), transgeneration studies of fenarimol at its low doses are not available. Objectives: The aims of this study are to address the effect of perinatal exposure to low doses of fenarimol on reproductive performance and to investigate molecular and cellular mechanisms which are associated with. Methods: The body and organ weights and anogenital distance (AGD) of mice offspring (F1) maternally exposed to fenarimol were determined, and their reproductive performances were assessed by mating and ovarian follicular and sperm analyses. In addition, differentially expressed genes (DEGs) in F1 ovaries were identified by DNA microarray. Up-regulated genes were confirmed by quantitative real-time PCR (qRT-PCR) and immunohistochemical analysis. Results: Fenarimol-exposed F1 mice showed the shortened AGD, increased body weight with altered organ weights, increased number of pub, abundant follicles, and enhanced sperm count and quality. Microarray data showed 82 up-regulated and 742 down-regulated genes on the ovaries of fenarimol-exposed mice, in which Cyp17a1 and Cyp19a1 were up-regulated. Conclusions: Low doses of perinatal fenarimol exposure caused reproductive dysfunction in mice and thus can possibly impose risks on reproductive activities of human and wild-life.

Some mutations in FOXL2 are responsible for premature ovarian failure accompanied with blepharophimosis-ptosis-epicanthusinversus syndrome (BPES) typeI disease, and FOXL2-null mice exhibit developmental defects of granulosa cells. Recently, a new somatic mutation in FOXL2,c.402C>G, leading top. C134W change, has been identified in a vast majority of adult-type ovarian garnulosa cell tumors (GCTs). In the current study, we investigated possible mechanisms by which the C134W mutation could contribute to GCT development. The wild-type (WT) FOXL2 and its mutant form displayed differential apoptotic activities, in which WT induced a significant granulosa cell death while the mutant exhibited a minimal cell death effect. The FOXL2-induced apoptotic response was greatly dependent on caspase8, BID, or BAK since the depletion of either of them prevented FOXL2 to elicitits full apoptotic responses. Stimulated activation of caspase8, consequently resulting increased production of truncated BID (tBID), up-regulation and oligomerization of BAK, and release of cytochromec were all associated with the apoptosis followed by WT FOXL2 expression. In contrast, the mutant FOXL2 was deficient to elicit the full apoptotic signaling responses. In addition, we found the differential up-regulations of expression of death receptors including Fas and TNF-R1 between the WT and the mutant. Moreover, granulosa cells expressing either the WT FOXL2 or its variant form (C134W) exhibited distinct cell death sensitivities by the activation of death receptors. Thus, these differential activities of FOXL2 and it mutant may partly account for the pathophysiology of GCT development occurred by the somatic mutation (C134W) of FOXL2.

Spc25 is a component of the Ndc80 complex which consists of Ndc80, Nuf2, Spc24, and Spc25. Previous work has shown that Spc25 is involved in regulation of kinetochore microtubule attachment, localization of Ndc80, and the spindle assembly checkpoint in mitosis. The role of Spc25 in meiosis remains unknown. Here, we report its expression, localization and functions in mouse oocyte meiosis. The Spc25 mRNA level gradually increased from the GV to MI stage, but decreased by MII during mouse oocyte meiotic maturation. Immunofluorescent staining showed that Spc25 was restricted to the germinal vesicle, and associated with chromosomes during all stages after GVBD. Overexpression of Spc25 resulted in oocyte meiotic arrest, chromosome misalignment and spindle disruption. Conversely, Spc25 RNAi resulted in precocious polar body extrusion and caused severe chromosome misalignment and aberrant spindle formation. Spc25 RNAi affected Ndc80 localization, but Ndc80 RNAi did not affect Spc25 localization.Survivin MO caused Ndc80 dispersion but did not affect localization of Spc25. Our data suggest that Spc25 is required for chromosome alignment, spindle formation, and spindle checkpoint activity through the regulation of Ndc80, but that Spc25 function is independent of survivin during meiosis.

Mitochondria are important regulators of both apoptosis and autophagy. One of the triggers for mitochondrial-mediated apoptosis is the production of reactive oxygen species (ROS), which include hydrogen peroxide, superoxide, hydroxyl radical, nitric oxide, and peroxynitrite. Recently, several studies have indicated that ROS may also be involved in the induction of autophagy. In the present study, we used H2O2 to induce mitochondrial stress and examined apoptotic- and autophagic-related gene expression and observed LC3 protein (autophagosome presence marker) expression in porcine parthenotes developing in vitro. In porcine four-cell parthenotes cultured for 5 days in NCSU37 medium containing 0.4% BSA, the developmental rate and mitochondrial distribution did not differ from that of the group supplemented with 100 μM H2O2 but significantly decreased in the group supplemented with 500 μM H2O2 (P<0.05). Transmission electron microscopy (TEM) indicated that whereas normal shaped mitochondria were observed in blastocysts from the control group, abnormal mitochondria (mitophagy) and autophagic vacuoles were observed in blastocysts from the group that received 500 μM H2O2. Furthermore, addition of H2O2 (100 μM and 500 μM) decreased cell numbers (P<0.05) and increased both apoptosis (P<0.05) and LC3 protein expression in the blastocysts. Real time RT-PCR showed that H2O2 significantly decreased mRNA expression of anti-apoptotic gene Bcl-xL but increased pro-apoptotic genes, Caspase 3 (Casp3) and Bak, and autophagy-related genes, microtubule-associated protein 1 light chain 3 (Map1lc3b) and lysosomal-associated membrane protein 2 (Lamp2). However, the addition of H2O2 had no effect on mRNA expression levels in nuclear DNA-encoded mitochondrial-related genes, cytochrome oxidase (Cox) 5a, Cox5b, and Cox6b1, but decreased mitochondrial DNA-encoded genes, D-loop (Dloop) and cytochrome b (Cytb), in blastocysts. These results suggest that H2O2 leads to mitochondrial dysfunction that results in apoptosis and autophagy, which is possibly related to porcine early embryo development.

Autophagy is an evolutionarily conserved lysosomal pathway for degrading cytoplasmic proteins, macromolecules, and organelles, in addition to recycling protein and ATP synthesis. Although programmed cell death (PCD) is very important during embryogenesis, the mechanism underlying the dynamic development during this process remains largely unknown. In order to obtain insights into autophagy and it's relation with apoptosis in early embryo development, we first evaluated LC3 gene expression levels in mouse embryos developing in vitro. qRT-PCR revealed high expression levels from 1- to 4 cell stage embryo, and then expression decreased during morula and blastocyst formation. Indirect immunocytochemistry showed protein synthesis of LC3 in these stage embryos. Introducing of autophagy inhibitor, 3-MA (2mM) significantly decreased both developmental rate (54.85±11.0%) and total cell number (n=71±8), but increased apoptosis rate (5.68± 1.9%) at the blastocyst. Real time RT-PCR confirmed reduced expression of selected autophagy related genes, including ULK1, Atg4A, B, C, D, Atg5, Atg8, Gabarap, Atg9A, B and Atg16L. Treatment of autophagy inducer, rapamycin (50 ng/㎖) increased both mRNA expression and protein synthesis of LC3 and apoptosis rate (16.11±3.42%), but decreased developmental rates (50.16±9.78) and total cell numbers (n=60±7) as compared to control developmental rate (70.74±12.9%), Total cell number (89.8±9) and apoptotic cell death (1.11±0.7%). These results suggest that autophagy is related with apoptosis in mouse embryo, which possibly give a role for early development.

Pregnancy-associated plasma protein-A (PAPP-A) is a 200 kDa metalloprotease identified as an IGFBP-4 protease and likely an important regulator of IGF bioavailability. PAPPA mRNA is detected in bovine granulosa and theca cells and the PAPP-A protein is also found in follicular fluid. Proteolytic activity supposed to be due to the PAPP-A in bovine follicular fluid is induced by follicle stimulating hormone (FSH) treatment and PAPP-A-like activity appears concomitantly with increased E2 during follicular development. However, the effects of FSH, E2 and progesterone on the expression of PAPP-A in bovine corpus luteum of pregnancy have been evaluated in a limited number of studies. This study was performed to expression of PAPP-A and progesterone during early pregnancy in bovine corpus luteum. To determine the function of PAPP-A gene during early pregnancy, we collected the bovine pregnancy corpus luteum samples on 30, 60 and 90 day of pregnancy. The mRNA expression of PAPP-A, progesterone-receptor, VEGF and IGFBP4 gene was conducted by real-time PCR. And proteins expression of PAPP-A and progesterone antibody was detected by Immunohistochemistry and ELISA. The VEGF and PAPP-A mRNA expression was progressively increased on day 90 in the pregnancy corpus luteum. The mRNA expression of progesterone-receptor, IGFBP4 in the corpus luteum progressively was increased from 30 to 60 day, but decreased on 90 day of pregnancy. The proteins expressions of progesterone and PAPP-A were similar pattern in mRNA expression. Our results indicate that the IGFBP4 protease role of PAPP-A increases in response to pregnancy 90 day corpus luteum and suggest that progesterone is an connected for the expression of PAPP-A genes in luteal cells. Therefore, we suggest that PAPP-A stimulated with progesterone play a crucial role for IGF-I system in bovine early pregnancy. And could be used to predict the condition of normal pregnancy.

Mammalian spermatogenesis takes place in the seminiferousepithelium, which is composed of Sertoli cells and germ cells. The interaction between spermatogenic and Sertoli cells as well as elongated spermatids and Sertoli cells is tightly regulated by junctional adhesion molecules (JAMs). JAMs, which are cell adhesion molecules, are known to play roles in various biological processes such as fertilization, neurogenesis, cancer progression, and spermatogenesis. Members of the JAM family have a unique structure: they contain an N-terminal signal peptide domain, immunoglobulin (Ig)-like domains, transmembrane and cytoplasmic tail domains, each of which has distinct functions. The extracellular Ig-like domains interact in a homophilic or heterophilic manner, whereas cytoplasmic tail domain mediates the tight junction assembly. Although members of the JAM family are exclusively present in or restricted to the testis, their precise roles in spermatogenesis and fertilization have not yet been completely explored. The functional roles of Nectin-2, Nectin-3, JAM-C, cell adhesion molecule1 (CADM1), coxsackie and adenovirus receptor (CAR) have been evaluated by analysis of null mutant mice. Unfortunately, CAR-deficient mice had an embryonic lethal phenotype; this demonstrates the importance of CAR in development, but its physiological role in spermatogenesis is not known. The loss of CADM1, Nectin-3 and JAM-C resulted in male infertility caused by loss of adhesion between germ and Sertoli cells. A variety of JAMs participate in the interaction between germ and Sertoli cells. Recently, human VSIG1 has been characterized, which was originally known as A34, as a new member of the JAM family; VSIG1 is composed of two extracellular Ig-like domains, a transmembrane domain, and a cytoplasmic domain. However, this molecule has not been functionally characterized, so this was one of the aims of our present study. RT-PCR and immunoblot analyses were used to study VSIG1 expression, VSIG1 was specifically expressed in testicular germ cells but not in sperm. Pull-down assay with glutathione S-transferase (GST) or His-fused first Ig and second Ig domains of VSIG1 and SDS-PAGE under mild non-reducing conditions demonstrated that VSIG1 functions as an in vitro homophilic adhesion molecule. Furthermore, cells expressing a deletion of the C-terminus of VSIG1 failed to interact with ZO-1, the central structural protein of the tight junction. These findings suggest mouse VSIG1 interacts with an unknown molecule in Sertoli cells via its extracellular domain, while its cytoplasmic domain is needed for binding to ZO-1. Thus, we suggest mouse VSIG1 may play an important role in spermatogenesis rather than fertilization by forming heterophilic complex with a molecule similar to JAM family.

The objective of this study was to investigate the effects of oxygen tension during in vitro maturation of porcine oocytes on the nuclear maturation and differences in gene expression. Cumulus-oocyte complexes (COCs) were collected from ovaries obtained at a local slaughterhouse, matured for 44 hours in TCM199 supplemented with porcine follicular fluid (pFF) under 5% or 20% oxygen concentration. In results, oxygen tension had no significant effects on nuclear maturation. Relative poly(A) mRNA abundance of MnSOD, CCNB1, LDHA, G6PD, BCL, GPX1, IGFR2, GLUT1, BAX, GREM, PTGS2 was analysed in cumulus cells. GLUT1, G6PD, LDHA were up-regulated in the cumulus cells matured in low oxygen, suggesting a higher glucose uptake and an increase in anaerobic glycolysis, whereas CCNB, MnSOD were up-regulated in the cumulus cells matured in high oxygen, which suggest a higher activity of mitosis-promoting factor and antioxidant response. In conclusion, cumulus cells increase in glucose metabolism via anaerobic glycolysis under low oxygen concentration and show significant change in antioxidant against oxidant damage or apoptotic response under high oxygen concentration. For such an effect of cumulus cells, oocytes could be matured normally regardless of various oxygen concentration.

Controllable transgenic expression systems in transgenic animal model are valuable to the development of therapeutic approaches in human medical fields. The aim of this study was to 1) produce a transgenic cloned dog using inducible tetracycline vector system, and 2) investigate whether the transgenic cloned dog could be induced the transgene expression using doxycycline (Doxy). Canine fetal fibroblasts were infected with retroviral vectors designed to express the enhanced green fluorescent protein (eGFP) gene under the control of tetracycline-inducible promoter. For somatic cell nuclear transfer (SCNT), nucleus of an in vivo matured oocyte was removed and an eGFP expressed cell cultured with 1 ㎍/㎖ of Doxy was injected. After electrical fusion and chemical activation, the reconstructed embryos were transferred to a recipient and pregnancy diagnosis was performed by ultrasonography. Experiment I evaluated the mean fluorescence intensity (MFI) of infected cells while the cells were cultured in the presence of 1 ㎍/㎖ of Doxy for 5 days, and then in the absence of Doxy for 7 days using fluorescence-activated cell sorter. Experiment II was designed to produce an eGFP controllable transgenic cloned dog via SCNT. For verification of transgenic dog, experiment III was performed Southern Blot analysis and observation in vivo regulation of eGFP expression in the cloned dog treated with 100 ㎎/㎏ of Doxy every 2 days for 2 weeks under ultraviolet light. In experiment IV, western blot was used to detect eGFP increase and decrease in skin tissues of transgenic dog under the presence or absence of Doxy. In the results of experiment I, the MFI for infected cells was rapidly increased to approximately 42.3 times after 3 day-treatment compared to pre-treatment and quickly decreased 3 days after ceasing the treatment. In experiment II, a total of 203 embryos were transferred to nine recipients and three pregnant delivered three pups (Tet-on eGFP 0, Tet-on eGFP 1, and Tet-on eGFP 2) by C-sec and Tet-on eGFP 2 among them is still alive. All cloned pups were genetically identical to the donor cell. Tet-on eGFP 2 showed an apparent in vivo eGFP expression on her body after Doxy administration in experiment III. The result of Sothern blotting showed that the transgene insertion was detected from the three cloned dogs and all organs of Tet-on eGFP 1. Experiment IV indicated that a robust eGFP expression in skin tissue of Tet-on eGFP 2 rapidly increased after Doxy treatment and gradually decreased to basal level on 9 weeks after ceasing the treatment. In conclusion, we report here for the first time an inducible transgenic system in canine species and it can stably induce the transgene expression at intended time. This study has demonstrated the capacity to generate transgenic model dog which could regulate the transgene and it would contribute to human medical research fields.

국내 유용 양식품종인 새꼬막, Scapharca subcrenata은 돌조개 목 (Order Arcoida) 돌조개 과 (Family Arcidae)에 속하는 종으로써, 같은 과에 속하는 꼬막, Tegillarca granosa과 피조개, Scapharca broughtonii의 중간크기이다 (Kwon et al., 2001). 새꼬막이 국내 연 총생산량은 많게는 3,000 톤 가까이 되지만, 종패의 수급에 있어 주로 자연채묘에 의존하고 있기 때문에 지속적이고 양호한 채묘율을 기대할 수 있다. 새꼬막에 관련된 연구는 수온과 염분 등 환경요인에 의한 영향 (Nakamura, 2005; Shi et al., 2007; Fang et al., 2008), 생식주기 (Kim et al., 2008), 유생분포 (Kim et al., 2006), 채묘와 성장 (Lim and Hur, 2010) 등 그 보고되고 있지만, 꼬막에 비해 많지 않으며, 특히 국내의 경우 인공성숙 등에 관한 연구는 찾아보기 힘들다. 따라서 본 연구는 새꼬막의 성패를 이용하여 성 성숙에 있어 가장 중요한 요인 중 하나인 수온 상승만으로도 생식소의 발달 및 정상적인 난 발생이 진행되는지 파악하고자 하였다. 연구에 사용된 새꼬막의 크기는 각장 31.81±2.21 ㎜, 전중 9.87±1.94 g이었으며, 전라남도 고흥군의 여자만에서 채집하였다. 사육기간은 28일 간이었으며, 대조구는 일반수온으로 설정하였고, 가온구는 매일 0.5℃씩 수온을 상승시킨 후 20℃가 되는 시점에서 일주일간 수온을 유지하였다. 먹이는 Isochrysis galbana, Chactoceros calcitrans, Tetraselmis tetrathele 3종의 미세조류를 혼합하여 1 ton 수조에 3시간마다 200ℓ (5,000～6,000 cells/㎖)씩 자동급이장치에 의해 공급하였다. 매일 사망개체를 파악하여 생존율을 조사하였으며, 7일 간격으로 채집하여 성비, 생식소발달 및 생식소지수를 분석하였다. 또한, 가온성숙된 개체들을 대상으로 간출자극에 의한 산란유발을 실시한 후 정상적인 난발생이 이루어지는지 관찰하였다. 연구 종료 후 관찰된 새꼬막의 생존율은 대조구에 비해 낮은 생존율을 보이고 있었다. 성비는 암:수의 비가 대조구는 1:0.97로 별다른 차이를 보이지 않았지만, 가온구는 1:0.62로 암컷이 높게 나타났다. 비만도는 대조구와 가온구가 유의한 차이를 보이는 가운데 수온 17℃ 이상부터 증가폭이 높게 나타났다. 생식소발달빈도는 암․수 모두 대조구의 경우 발달이 느렸으며, 가온구는 수온 20℃인 사육 21일부터 28일 사이에 성숙기에 도달한 개체들이 80% 이상 관찰되었다. 생식소지수는 대조구에 비해 수온이 높을수록 증가하는 경향을 보였다. 수온 26℃ (32‰)에서 새꼬막의 수정란 크기는 직경 63.17±1.22 ㎛였으며, 수정률은 82.17±3.55%였다. 부화율은 63.57±2.36%였다. D형 유생의 발생소요시간은 수정 후 약 15시간으로 나타났으며, 크기는 각장 82.85±0.87 ㎛, 각고 72.65±1.07 ㎛였다.

지중해담치 Mytilus galloprovincialis는 대서양연안, 지중해, 홍콩 및 일본 남부증지에 분포하며, 한국에서는 동, 서, 남해안 그리고 제주도와 울릉도에서 채집된다 (Choe et al., 1999). 전남 여수시 가막만에서 양식되고 있는 지중해담치는 6～8월 동안 자연채묘하여 중간양성을 거친 후 이듬해 5～6월에 본양성을 위하여 시설되며, 그해 11월부터 수확이 시작된다. 조개류의 생식주기에 관한 연구는 주로 기초 생물학적 연구와 자원증대 및 양식기술 개발을 위한 기초자료를 제공하기 위하여 수행되어 왔다. 그 가운데 우리나라에 서식하는 조개류의 생식에 관한 연구로는 바지락, Ruditapes philippinarum의 생식소 발달과 연령 및 성장 (Chung et al., 1994), 대복, Gomphina veneriformis의 생식소 발달과 생식주기 (Park et al., 2003), 백합, Meretrix lusoria의 성 성숙과 배우자형성 (Chung and Kim, 2000) 및 개조개의 생식소발달과 생식주기(Shin et al., 2007)등 다수가 발표되고 있으나, 현재 양식 생산량이 많으며, 주요 양식대상종임에도 불구하고 국내에서 지중해담치의 생식생리에 관한 보고는 찾아보기 힘들다. 이매패류의 성 성숙 및 생식주기에 미치는 영향요인들 가운데 수온은 외인성 요인으로 여러 요인들 가운데 가장 중요하게 작용하는 요인이며 (Mackie, 1984), 수온은 주로 위도와 지리적 조건에 따라 달라진다. 최근 기후변화에 따라 연안 수온의 상승 및 강우량의 증가에 의해 연안에서 양식되고 있는 생물의 산란시기가 불규칙하여 자연 채묘 및 생산량의 변동이 초래되고 있는 실정이다. 본 연구는 여수시 가막만에서 양식되고 있는 지중해담치를 대상으로 생식생태학적 기초 자료인 성비, 생식소 발달, 생식소 지수, 비만도의 월 변화와 생식주기를 조사하여 산란시기 추정에 따른 채묘시기를 예측하고, 생산량 증가를 위한 적정양식시설의 재배치 및 적정생산량 산정을 위한 기초자료 제공을 위해 실시되었다. 본 연구에 사용한 지중해담치는 2009년 6월부터 2009년 12월까지 전남 여수시 가막만 해역에서 수하연 중간부분의 개체를 매월 30～40개체씩 채집하였다. 채집한 개체는 각장, 각고, 전중량 및 육중량 등의 측정형질을 계측한 후, 생식소가 포함된 내장낭의 일부를 Bouin's solution에 일정시간 고정한 후 파라핀 절편법으로 두께 4 ㎛의 조직표본을 제작하였다. 염색은 Mayer's hematoxylin과 0.5% eosin 비교염색을 행하였다. 생식소 발달단계는 회복 및 초기활성기I (Re & EaⅠ: recovery and early active stageⅠ), 초기활성기Ⅱ (EaⅡ: early active stageⅡ), 후기활성기 (La: late active stage), 완숙기 (R: ripe stage), 방출기 (S: spent stage)의 5단계로 나누었다. 담치의 비만도는 조사지역(원포, 소호)에서 암․수 모두 6월에 가장 높은 정점 (암: 0.046, 수: 0.050)을 나타냈다. 성비는 원포지역의 경우 1:0.94(암:수), 소호지역은 1:1.2(암:수)로 나타났으나 유의적인 차이는 없었다(P>0.05). 생식소 발달은 원포지역과 소호지역 모두 7월부터 산란 및 방정을 시작하여 12월까지 지속되었다. 생식소지수는 원포지역의 경우 암컷과 수컷 모두 6월에 가장 높은 값을 나타낸 후 감소하여 10월에 다시 증가하는 경향을 보여주고 있었고, 소호지역 역시 8월을 제외하고 원포지역과 동일한 경향을 나타내었다. 두 지역 모두 주 산란기는 7～9월로 추정되었다. 그러나 소호지역은 원포지역보다 생식소의 발달이 다소 느리며, 퇴화․흡수 후 휴지기에 들어가는 개체들의 비율이 낮게 관찰되었다.

인공 종묘생산 과정의 첫째 조건은 양질의 수정란을 확보하는 것이며, 산란유발은 생산성을 높이는데 필요한 선결과제이다. 그러므로 성숙한 어미로부터 일시에 대량의 수정란을 얻기 위한 여러 가지 방법들이 시도되고 있다. 따라서 본 연구는 가장 중요한 패류양식 종인 참굴, Crassostrea gigas를 대상으로 자극방법별 산란유발 효과를 조사하였다. 실험용 참굴은 산란기 (6～7월)에 각장 58.2～73.1 ㎜, 전중 87.5～93.2 g의 2년산 모패를 사용하였다. 참굴은 채집 즉시 실내수조에 수용하여 20～25℃의 신선한 여과해수를 흘려주면서 24시간 이상 안정시킨 다음, 2ℓ유리 비커에 각각 1개체씩 수용하여 수온상승, 공기노출, H2O2 침지, NH4OH 침지, serotonin 주사, dopamine 주사 등 자극을 주었다. 수온상승 자극에서는 20℃에 수용한 모패를 각각 2℃, 4℃, 6℃ 및 8℃씩 상승시켜 1시간 동안 자극하였고, 공기노출 자극에서는 기온 25℃에서 각각 1 h, 2 h, 3 h 및 4 h씩 노출시켜 자극하였다. H2O2와 NH4OH 침지에서는 각각 5×10－3 M, 1×10－3 M, 5×10－4 M 및 1×10－4 M의 농도로 처리하였다. 또한, 신경전달물질인 serotonin과 dopamine을 10－5, 10－4, 10－3 및 10－2 M 농도로 각 개체의 생식소에 0.2 ㎖ 씩 주사하였으며, 대조구에서는 같은 양의 멸균해수를 주사하였다. 유발효과는 자극방법에 따른 반응률과 자극 후 반응개시 시간을 조사하였으며, 그리고 동일한 처리로 얻어진 알과 정자를 인공수정하여 수정률과 부화율을 조사하였다. 참굴에 대한 산란유발 자극의 반응률은 암컷에서는 serotonin이 81.3±23.9%로 가장 높았으며, 다음으로 수온상승 80.4±24.3%, 공기노출 73.9±23.0%, H2O2 48.8±23.9%, dopamine 41.2±13.9%, NH4OH 28.6±25.4% 순이었다. 한편, 수컷에서는 수온상승이 93.8±12.5%로 가장 높았으며, serotonin 91.7±16.7%, 공기노출 90.8±10.7%, H2O2 57.5±28.7%, NH4OH 47.6±21.7%, dopamine 47.5±14.5%의 순으로 효과적이었다. 전반적으로 볼 때, 수컷이 암컷보다 민감하게 반응하는 경향을 띠었다. 반응까지의 소요시간은 암컷에서 serotonin 12.5±15.1분, dopamine 59.0±9.9분, 수온상승 105.5± 28.3분, 공기노출 129.5±37.9분, H2O2 160.0±23.6분, NH4OH 166.0±24.2분이었다. 수컷에서는 serotonin 7.5±7.0분, 수온상승 31.5±11.5분, dopamine 34.3±4.5분, 공기노출 46.0±17.5분, NH4OH 52.8±19.7분, H2O2 109.8±12.1분이었으며, 각 실험구에서 수컷이 암컷보다 빠르게 반응하였다. 수정률에서 NH4OH 88.9±1.9%, H2O2 95.6±1.9%, dopamine 96.7±3.3%였으며, 공기노출, 수온상승 및 serotonin은 100%의 높은 수정률을 보였다. 부화율에서 NH4OH 80.0±3.3%, 공기노출 85.6±5.1%, H2O2 92.2±1.9%, dopamine 94.4±3.8%, 수온상승 95.6±1.9%, serotonin 100% 순으로 높은 부화율을 보였다.

해양동물의 발생배 냉동보존에 관한 연구는 어류에서 그 결과가 미미한 반면, 패류에서는 Tiersch (2001)의 버지니아굴에 대한 유생 냉동보존을 비롯하여 Choi and Chang (2003)이 진주조개, Pinctada fucata martensii 발생배의 냉동보존 연구 등 대부분 조개류에 대하여 보고되었다. 한편, 고둥류에 대한 발생배 냉동보존 연구는 아직 초보 단계에 멈추어 있으며, 최근 Roux et al. (2008)에 의해 전복 발생배 냉동보존의 기초적인 지식이 얻어지기는 하였으나, 여전히 발생배를 냉동보존하는 데 있어 그 기초자료가 되는 여러 요인들에 관한 연구가 필요하다. 따라서 고둥류 발생배의 냉동보존 기술을 체계적으로 개발하기 위하여는 발생배의 냉동보존 시 초기발생 단계를 포함한 발생단계별 냉동효과, 침지실험에 의한 동해방지제, 평형시간 구명 및 최종적인 냉동보존 효과 파악을 위한 동해방지제별 활성영향, 적정농도 및 냉동실험이 체계적으로 이루어져야 한다. 이를 토대로, 본 연구에서는 고둥류 중 주요 산업종인 참전복, Haliotis discus hannai 발생배의 최적 냉동보존 조건을 파악하기 위하여 동해방지제 침지농도별 활성을 조사하였다. 완도산 참전복을 채란용 모패로 사용하였으며, 수온자극과 자외선조사해수자극을 병행한 산란유발 자극에 의해 수정란을 확보하였다. 동해방지제별, 농도별 침지에 따른 참전복 발생배에 미치는 활성을 파악하기 위해, 인공해수(NaCl 2.7 g, KCl 0.07 g, NaHCO3 0.05 g, CaCl2 0.12 g, MgCl2 0.46 g, Milli-Q water 100 ㎖)를 희석액으로 하고, 여기에 dimethyl sulfoxide (DMSO), ethylene glycol (EG), propylene glycol (PG)를 최종농도가 0.1, 0.5, 1.0, 2.0 M이 되도록 혼합한 다음, 발생배를 침지하였다. 30분 경과 시 발생배로부터 동해방지제를 깨끗이 제거한 후 10분 간격으로 1시간 동안 trochophore, veliger의 생사 여부 및 운동성을 관찰하였다. 이때 광학현미경(×100)의 한 시야에서 움직이는 유생을 다음의 유생운동 평가표에 따라 유생활성지수(larval activity index, LAI)를 산정하였으며, 모든 실험은 3반복으로 실시하였다. 참전복의 발생단계 중 유생의 섬모운동을 시작하는 단계인 trochophore, veliger를 사용하여 동해방지제별, 농도별 침지에 따른 발생배에 미치는 활성을 관찰한 결과, 각 유생의 LAI는 모든 동해방지제의 0.1 M 농도에서 높았으며, 농도가 높을수록 LAI가 낮아짐을 알 수 있었다. 동해방지제 침지농도에 따른 유생의 반응은 농도가 낮은 실험구에서 비대칭 나선운동이 멈추었으나, 농도가 높아질수록 섬모운동을 멈추고 움직이지 않는 채로 심장박동만 관찰되었다. Trochophore보다 veliger를 사용한 실험구에서 전체적으로 LAI가 높아 veliger를 사용한 실험구가 trochophore 실험구보다 동해방지제에 대한 내성이 강한 것으로 나타났다. 각각의 동해방지제 중에서 EG에 침지한 유생의 LAI가 다른 동해방지제보다 유의하게 높아, EG가 참전복 발생배의 활성에 영향을 덜 미치는 것으로 판단된다.

2007년 12월 7일 충남 태안 해상에서 발생한 Hebei Spirit호 유류오염 사고로 원유 12,547 ㎘가 유출되어 서해안의 167 ㎞에 이르는 해안선이 오염됨으로서 이곳에 서식하고 있는 패류, 어류 등 양식생물들과 같은 유용 수산자원은 큰 영향을 받았을 것으로 판단된다. 유류에 노출된 굴, Crassostra gigas은 외부에서 정상적인 먹이 섭취활동이나 에너지 대사 작용을 하지 못하여 생체량의 감소가 나타나 산란량에 크게 영향을 미칠 것으로 예상된다. 본 연구는 유류유출사고 피해지역인 태안군 원북면 신두리 및 소원면 의항리와 유류오염에 노출되지 않은 경기도 안산시 종현동의 참굴 집단을 대상으로 11개의 microsatellite DNA marker를 이용하여 계절적인 차이를 두고 유전적 특성을 비교하고, 유류오염에 대한 참굴 집단의 유전적 다양성 변화에 대해서 조사하고자 msDNA 마커의 유전자형을 분석하였다. 유류 오염지역과 비오염지역 굴에 대하여 11개의 microsatellite DNA marker로 유전자형을 분석한 결과, marker에 따라 대립유전자 수가 19개에서 42개로 매우 다양하였으며, 평균 대립유전자 수는 약 33개, 대립유전자 수 보정치 (Allelic richness)는 약 32개로 모든 집단에서 비슷하게 나타났다. 이형접합체율 관찰값 (Ho)은 경기 9월 집단의 ucdCg-161에서 0.602로 가장 낮았고, 태안 3월 집단의 ucdCg-109에서 0.979로 가장 높게 나타났다. 이형접합체율 기댓값 (He)은 경기 3월과 태안 9월 집단의 ucdCg-130에서 0.886으로 가장 낮았고, 경기 9월의 유전자좌 ucdCg-133에서 0.972로 가장 높았다. 평균 이형접합체율 관찰값 (Ho)과 기댓값 (He)은 각각 0.762～0.798과 0.948～0.952로 계절적, 지리적으로 비슷한 수준을 보였다. 다형성정보지수 (PIC)에서도 경기 3월 집단의 ucdCg-130에서 0.871로 가장 낮았고, 경기 9월 집단의 ucdCg-133에서 0.966으로 가장 높았으며, 각 집단의 평균은 0.940～0.944로 계절적, 지리적인 차이는 없었다. Hardy-Weinberg equilibrium (HWE)에서는 태안 9월 집단의 ucdCg-130에서 유의한 이탈이 나타나 유전적 불균형의 징후가 보였다. 대립유전자 빈도를 바탕으로 계산되는 Linkage disequilibrium (LD)을 기초로 한 유효집단크기 (Ne)에서는 경기 9월 집단이 76,395마리로 가장 높았는데, 이것은 genetic linkage, 재조합률, 돌연변이율, random drift, non-random mating 등을 포함하는 여러 원인과 집단구조에 의해 영향을 받기 때문에 과대평가되는 경향이 있다. 각 집단의 유효집단의 크기는 비오염 지역의 경우 3, 5월 집단이 각각 753마리, 1,494마리로 나타났으나, 오염지역의 경우, 3, 5, 9월 집단이 현재의 다양성을 유지하기 위해서는 각각 450마리, 660마리, 546마리로 매우 낮게 나타나 비오염 지역에 비해 다양성이 현저하게 낮아진 것으로 사료된다. 각 집단에 대한 유전적분화에 의해 야기되는 아집단내의 이형접합체율의 감소정도를 나타내는 FST를 유의차 검정 (P<0.05)에 의한 P값을 반영하여 각 집단 간을 비교한 FST 값에서는 태안 5월 집단이 경기 3월, 5월, 9월 집단 그리고 태안 3월 집단 사이에 유의한 차이가 보였다. 대립유전자 빈도를 근거로 하여 Nei's genetic distance에서는 0.1035～0.1497로 나타났으며, 태안 5월 집단에 비교적 높은 수치가 보였다. UPGMA와 Neighborjoining 방법으로 계통수를 만들어 참굴 집단 간 유연관계를 확인한 결과, 계절적, 지리적인 집단 간의 특별한 차이는 찾을 수 없었다. 계절적, 지리적인 집단 사이의 차이는 크게 나타나지 않았으나, 유류오염이 산란에 미친 영향 파악을 위해 유전적 특성의 변화를 지속적으로 관찰하는 연구가 요구된다.

대부분 이매패류의 성은 자웅이체이며, 체외수정을 한다. 하지만 화학물질 등을 비롯한 다양한 외부환경요인 등에 의하여 자웅동체 또는 성의 교란이 나타나기도 한다. 수질오염원으로 확인되는 화학물질 가운데 한 종류인 내분비계장애물질 (endocrine disrupting chemicals: EDCs)은 androgenic effector나 estrogenic effector로서 수서동물의 생식관련 내분비계를 교란시켜 성의 표현이나 기능을 변화시킨다 (Ackermann et al., 2002; Metrio et al., 2003; Quinn et al., 2004). EDCs에 의한 이매패류의 생식저해, 성비 불균형, intersex 등의 생식이상은 굴, Crassostrea gigas (Mori et al., 1969), Mya arenaria (Gauthier-Clerc et al., 2002), Dreissena polymorpha (Quinn et al., 2004), 대복, Gomphina veneriformis (Lee and Park, 2007; Ju et al., 2009) 등에서 보고된 적이 있다. 우리나라에서 굴과 바지락은 수산자원 학적 측면에서 생산량이 높은 중요한 생물자원 가운데 하나로서 해양생태계의 관리, 생물자원의 보존 및 수산물 안전성 측면에서 관리가 필요한 종이다. 본 연구는 우리나라의 남해안 일부지역에서 굴과 바지락의 intersex 현상이 관찰되어 이를 보고하고자 한다. 분석에 사용한 굴은 통영, 거제, 여수의 각각 2지역에서 모두 6개 지역, 바지락은 여수의 5개 지역에서 채집하였으며 모두 자연산이었다. 분석 개체수는 굴 363개체와 바지락 221개체였다. 채집한 시료는 측정형질을 계측한 후 해부하여 생식소가 포함된 내장낭 부위를 적출하여 Bouin 용액으로 12～24시간 동안 실온에서 고정하여 파라핀 절편법으로 4～6 ㎛ 두께로 연속 절편하여 조직표본을 제작한 후 Mayer's hematoxylin-eosin (H-E) 염색을 실시하여 광학현미경 (BX50F4, Olympus, Japan)으로 관찰하였다. 성비와 intersex는 생식소 표본을 관찰하여 구분하였다. Intersex는 개체당 평균 1 ㎠ 크기의 조직표본 5～10개를 대상으로 관찰하였으며, 반대 성의 생식세포가 관찰되는 경우만을 포함하였으며, 다른 성징은 포함하지 않았다. 조직학적인 측면에서 intersex 현상은 반대 성의 생식세포들이 생식세포형성소낭 내부와 소낭 사이에서 단독 또는 무리지어 나타나는 형태였으며, 생식소 외부에 다른 체 조직이 형성되어 이곳에 반대 성의 생식세포들이 발달된 형태는 관찰되지 않았다. Intersex 현상이 관찰된 난소에서는 변성된 난모세포들이 확인되거나 소화선의 구조적 이상을 보였다. 굴에서 intersex 출현율은 16.25% (n=59/363)였다. 성별로는 암컷에서는 24.79% (n=30/121), 수컷에서는 11.98% (n=29/242)로 수컷보다 암컷에서 높게 나타났다. 6개 지역 가운데 여수 중앙동 장군도에서 44.0%로 가장 높았다. 바지락에서 intersex 출현율은 24.43% (n=54/221)였다. 성별로는 암컷에서는 37.76% (n=37/98), 수컷에서는 13.82% (n=17/123)로 굴과 마찬가지로 수컷보다 암컷에서 높게 나타났다. 5개 지역 가운데 화양면 삼도에서 38.1%로 가장 높았다.

대부분 경골어류의 성은 자웅이체이며, 생식소 분화시기에 결정된 형태학적 성이 일생동안 지속된다. 하지만, 형태학적 성이 완성된 이후에도 외부환경요인 등에 의하여 자웅동체 또는 성의 교란이 나타나기도 한다. 경골어류의 성과 생식에 영향을 미치는 환경요인 가운데 하나인 EDCs는 생물의 내분비계 작용기작에 비정상적으로 작용하여 호르몬 생산, 분비, 이동, 대사, 결합작용 및 배설을 간섭하는 외인성 물질이다. 많은 연구자들은 EDCs는 androgenic effector나 estrogenic effector로서 각각 다른 기작에 의해 수서동물의 생식관련 내분비계를 교란시켜 성의 표현이나 기능을 변화시킨다고 보고하였다 (Ackermann et al., 2002; Metrio et al., 2003; Quinn et al., 2004). 본 연구에서는 우리나라 남해안의 광양만에서 채집된 주둥치, Leiognathus nuchalis의 성비 불균형 및 intersex 현상을 보고하고자 한다. 연구에 이용된 주둥치는 2009년 7월에 남해안 광양만 인근 해역에서 채집된 80개체였다. 채집된 개체들은 해부하여 생식소를 적출하였다. 생식소는 전, 중, 후 세 부분으로 나누어 Bouin 용액으로 12～24시간 동안 실온에서 고정하였다. 그 후 파라핀절편법으로 4～6 ㎛ 두께로 연속절편하여 조직표본을 제작한 후 Mayer's hematoxylin-eosin (H-E) 염색을 실시하여 광학현미경 (BX50F4, Olympus, Japan)으로 관찰하였다. 성비와 intersex는 생식소 표본을 관찰하여 구분하였으며, intersex는 반대 성의 생식세포가 관찰되는 경우만을 포함하였으며, 다른 성징은 포함하지 않았다. 성비 (암:수)는 1:0.27 (n=63:17)로 암컷의 비율이 높게 나타났다. 조직학적인 측면에서 intersex 현상은 반대 성의 생식세포들이 생식소 내부에 산재되어 나타나는 형태와 생식소 외부에 다른 체 조직이 형성되어 이곳에 반대성의 생식세포들이 발달된 형태를 나타냈다. Intersex 현상이 관찰된 암컷 개체들의 난소에서는 변성된 난모세포들이 확인되거나 초기의 난소 발달단계를 보였다. 또한, intersex 현상이 관찰된 수컷의 정소에서 확인된 난모세포들도 난황형성전기 (previtellogenic stage) 또는 난황형성개시기 (initial vitellogenic stage)의 초기단계였다. 80개체의 주둥치 생식소를 분석한 결과, intersex 출현율은 31.3%였다. 성별로는 수컷에서 64.71%로 암컷 22.22% 비해 뚜렷이 높게 나타났다.

대부분 생물의 생리적 활성은 일정한 주기성을 가진다. 그 중 어류의 번식주기는 생식 내분비계의 영향을 받고 있는데, 이를 조절하는 여러 가지 외부 환경인자들(수온, 조석, 빛, 염분, 먹이영양 등)이 존재하고 각각 종 특이성을 나타낸다. 이러한 외부인자들은 어류의 중추신경계의 활동을 지배함으로써 생식호르몬 분비를 제어한다. 이 연구의 실험어인 홍바리, Epinephelus fasciatus는 농어목(Perciforme), 바리과(Serranidae), 능성어속(Epinephelus)으로 전 세계적으로 기호도가 아주 높은 아열대성 어종이다. 이 연구에서는 환경인자(특히, 광주기와 수온)의 조절을 통한 홍바리의 생식소 발달과 성숙 유도를 통한 번식 메커니즘을 규명하는데 그 목적이 있다. 이 연구를 위해서 제주대학교 해양과환경연구소의 순환여과 수조에서 홍바리를 사육하였으며, 실험수조는 광주기 조절에 의해 12시간 명기 12시간 암기 (12L:12D)의 광조건을 지속적으로 유지한 대조구와 13L:11D에서 14L:10D의 광조건으로 변화시킨 실험구로 나뉘었고 수온은 22℃를 유지하였다. 수온에 의한 영향을 조사하기 위해 대조구와 처리구의 수온을 실험 시작 9주후부터 22℃에서 25℃로 상승시켰다. 실험어는 생식소숙도지수(GSI, gonadosomatic index)를 산출되었으며, 조직학적 관찰을 위해 Hansen's haematoxylin과 0.5% eosin으로 비교염색을 실시하였다. 난경의 변화는 난소의 절편을 촬영한 후, Motic Image plus 2.0으로 난모세포의 크기를 측정하여 조사하였다. 그 결과 모든 광주기 조건의 실험어들은 22℃의 수온에서 생식소중량지수가 0.5±2.5로 매우 낮게 나타났으며, 어린 주변인기 난모세포(난경 60.9±3.4 ㎛)가 대부분을 차지하였다. 하지만 수온을 25℃로 상승시킨 후 14L:10D의 실험구의 어류들에서 생식소중량지수가 4.5로 증가하였으며, 난소내 난모세포 분포는 난황구기 난모세포(난경 400 ㎛ 이상)가 대부분을 차지하였다. 12L:12D의 광조건인 대조구에서는 25℃로 수온상승 후에도 생식소의 발달이 이루어지지 않았다. 이러한 결과에서 홍바리는 장주기 광조건뿐만 아니라, 특히 수온 25℃ 이상의 환경조건이 생식소 발달 및 성성숙 유도에 강한 영향이 미치는 것으로 사료된다.

모든 척추동물은 번식, 성장, 대사, 생체방어로 이루어진 생물 고유의 현상을 나타내며, 그 중 번식과 성장은 서로 밀접한 연관성을 가지고 있다. 성장을 조절하는 주요 내분비 인자로는 세포의 증식과 비대, 아미노산 수송이나 단백질 합성의 촉진, 지방분해의 기능을 수행하는 성장호르몬(GH, growth hormone)과 인슐린성 성장인자-Ⅰ형(IGF-Ⅰ, insulin-like growth factor)가 존재한다. 그리고 번식을 조절하는 주요 내분비 인자로는 생식소자극호르몬 방출호르몬(GnRH, gonadotropin releasing hormone)과 황체형성 및 최종배란에 영향을 미치는 생식소자극호르몬(GTH, gonadotropin)이 서로 상보적 기능을 통해 생식소의 발달을 조절한다. 이 연구에서는 바리과 어류인 홍바리, Epinephelus fasciatus의 성장과 성성숙과의 관계를 탐색하기 위한 기초연구로서 성장조절인자 GH, IGF-Ⅰ, IGF-Ⅱ와 번식조절인자 GTH(FSH, LH)의 부분염기서열을 조사하였으며, 중추신경과 주변 각 기관에서의 발현 유무를 RT-PCR을 이용하여 확인하였다. GH mRNA는 시상하부에서만 발현이 나타났으며, IGF-Ⅰ mRNA역시 시상하부에서 가장 강한 발현과 소뇌, 시엽, 후엽에서 약한 발현이 나타났다. 또한, 주변조직에서는 간 조직에서 강한 발현이 나타났으며, 생식소에서는 약하게 발현되었다. IGF-Ⅱ mRNA는 소뇌에서 가장 강하게 발현하였으며, 소뇌, 시상하부, 시엽, 후엽과 생식소에서 약하게 발현하였다. FSH와 LH mRNA 발현의 경우, 두 유전자 모두 뇌하수체에서 가장 강하게 발현되었으며, 시상하부에서 약하게 발현이 나타났다. 이러한 결과들로 볼 때, 홍바리 뇌의 중추신경계에서 성장과 번식의 조절과 관련된 신경전달회로를 중점적으로 지배하고 있으며, 이러한 신경센서를 통한 주변조직의 생리적 메커니즘에 서로 직·간접적으로 영향을 미치는 것으로 사료된다.

Somatostatin(SS)은 뇌의 시상하부에서 분비하는 growth hormone release-inhibiting hormone (GH 방출억제 호르몬)으로서 체성장을 저해한다고 알려졌지만, 최근에는 중추신경뿐만 아니라 여러 주변조직에서도 넓게 분포하며 먹이섭식, 소화, 성 스테로이드 호르몬조절, 해수적응 등의 다양한 생리적 역할에 관여한다고 보고되고 있다. 포유류에서의 SS는 somatostatin 1(SS1)과 somatostatin 2(SS2), 두 개의 SS isoform으로 존재한다. SS1과 SS2는 각각의 전구단백질(preprosomatostatin, PSS)인 prepro-SS1(PSS1)과 prepro-SS2(PSS2)에 의해 합성되고, 어류에서는 제 3의 SS isoform인 somatostatin 3(SS3)가 prepro-SS3(PSS3)에 의해 합성되고 있음이 밝혀졌다. 하지만 SS와 그 전구체인 PSS에 대해서는 주로 포유류 대상으로 대부분의 연구가 이루어졌을 뿐, 어류에 있어서는 그 분자적인 특성, 발현양상 그리고 그 생리적 역할에 대해서 현재까지도 불분명한 점이 많다. 이 연구에서는 양식 넙치, Paralichtys olivaceus를 대상으로 각 조직에서 발현되는 PSSs를 cloning하여 각각의 유전자를 특정하고, 발현양상을 조사하여 그 기능적 역할을 밝히는데 목적이 있다. 넙치의 시상하부에서 PSS 유전자를 cloning한 결과, 그 subtype으로 PSS1, PSS2 그리고 PSS3가 존재하는 것을 확인하였으며, 약 196～258 bp범위의 각각의 부분염기서열을 분리하였다. 또한 PSSs mRNA의 각 조직별 특이적 발현을 확인하기 위하여 중추신경조직인 시상하부와 뇌하수체, 그리고 주변조직인 간과 신장, 장, 생식소 등을 적출하여 RT-PCR 방법을 이용해 조사하였다. 각각의 중추신경조직과 주변조직들에서 PSSs mRNA의 발현이 각각 다른 양상을 나타내었다. 이러한 결과들로 볼 때 넙치에 있어서 PSS의 subtype들은 각각의 조직들에서 서로 다른 생리적 활성과 메커니즘을 나타낸다고 볼 수 있고, 추후의 연구에서는 각 유전자들의 그 기능적 역할에 대하여 연구를 지속적으로 진행할 필요가 있다고 본다.

최근 생물다양성 연구가 세계적으로 진행됨에 따라 돗돔, 홍어 등 어획자원 격감어종의 종 보존에 대한 관심이 고조되고 있다. 희귀어종으로 대형종인 돗돔은 전설의 물고기라 불리우며, 그 맛도 일품인 것으로 알려져 있다. 이 돗돔의 자원증강을 위한 종 보존 및 양식기술을 개발하기 위하여, 일부 연구기관에서는 현장에서 어획된 돗돔으로부터 종묘생산을 시도하고 있지만, 어획된 돗돔 어미의 성비가 부조화하거나, 완숙된 알과 정자의 동시 구득이 어려워 인공수정 작업이 불가능한 실정이다. 따라서 자연산 돗돔의 원만한 인공수정을 위하여 배우자의 냉동보존 기술이 필요하다. 본 연구에서는 돗돔의 효과적인 정자 냉동보존 방법을 구명하고자 동해방지제별, 농도별 정자의 활성지수 및 운동시간을 조사하였다. 실험용 돗돔은 전장 165 ㎝, 체중 90 ㎏인 자연산 수컷 돗돔으로서 동경 128˚ 35″, 북위 35˚ 04″ 해역에서 낚시로 어획하였다. 정액은 복부압박법을 이용하여 채취하였으며, 채정전 불순물이 섞이는 것을 방지하기 위해 사전에 배설물을 제거하였다. 채취한 정액은 냉동보존 실험전까지 빙냉상태로 유지하였다. 냉동실험에서 희석액으로 0.5 M glucose, 동해방지제로 dimethyl sulfoxide (DMSO), propylene glycol (PG), ethylene glycol (EG), glycerol (각각 5%, 10%, 15%, 20%)을 사용하였다. 평형시간은 3분으로 하였고, 그 후 액체질소증기 －76℃에서 3분간 완만냉동한 뒤, 액체질소(－196℃)에서 즉시 급속냉동하였다. 냉동정자의 활성과 운동지속시간을 비교하기 위해 20℃ 지하수에 급속 해동한 다음, 인공해수에 넣고 광학현미경으로 관찰하여 다음의 정자운동 평가표에 따라 운동활성을 비교하였다. 동해방지제별, 농도별 돗돔 정자의 SAI 및 운동지속시간은 PG 5%에서 각각 0, 0분, 10% 1, 1.6분, 15% 3, 5.0분, 20% 2, 3.1분이며, EG의 경우, 5% 0, 0분, 10% 1, 2.3분, 15% 2, 4.5분, 20% 3, 4.7분이었다. Glycerol에서는 5%, 0, 0분, 10% 0, 0분, 15% 3, 5.0분, 20% 4, 5.9분으로 나타났으며, DMSO에서는 5% 0, 0분, 10% 1, 1,7분, 15% 2, 3.0분, 20%에서 1, 1.8분으로 나타났다. Glycerol의 농도 15%, 20%일 때 SAI는 각각 3, 4로 모든 실험구에 비해 가장 높았다. 반면, DMSO에서는 glycerol에 비해 운동성 및 운동지속시간이 낮게 나타났는데, 그 이유는 DMSO의 독성으로 인해 운동성이 낮은 것으로 판단된다. 이는 동해방지제별 종 특이성에 의해 기인하는 것으로 생각되어지며, 돗돔 정자의 적정 동해방지제는 glycerol인 것으로 판단된다.