본 실험은 돼지체외수정란을 생산하는데 적합한 배양액과 산소조건을 구명하기 위하여 NCSU(North Carolina State University)-23, PZM(Porcine Zygotes Medium)-3, PZM-4 및 TCM(Tissue Culture Medium)-199 배양액과 5% 산소조건(39, 5% O₂, 5％ CO₂, 90% N₂ 및 포화습도) 및 20% 산소조건(39, 5% CO₂ 및 포화습도)에서 돼지 미성숙난포란의 체외성숙과 체외배발달을 실시하였다. 본 연구에서 얻어진 결과를 요약하면 다음과 같다. 1) 돼지 난포란을 5 및 20% 산소조건하에서 NCSU-23, PZM-3, PZM-4 및 TCM-199 배양액에 44시간 동안 성숙을 유도한 결과 난핵포붕괴율과 핵성숙률에 있어서 산소조건 및 배양액간 유의적(p>0.05)차이는 없었다. 2) 체외수정을 실시한 결과 정자 침투율, 자ㆍ웅전핵형성률, 다정자 침입률 및 평균정자수에 있어서 산소조건 및 배양액간에 유의적인 차이가 없었다. 3) 체외수정을 실시한 후, 5 및 20% 산소조건의 NCSU-23, PZM-3, PZM-4 및 TCM-199 배양액에서 배양하여 배발달에 미치는 영향을 조사한 결과, 난할률에 있어서는 유의적(p＜0.05)인 차이가 없었으며. 배발달 7일째 배반포기 발달률에 있어서 5% 산소조건에서는 PZM-3 배양액이, 20% 산소조건에서는 NCSU-23 배양액이 유의적(p＜0.05)으로 높은 결과를 나타냈다. 4) 배발달 7일째 배반포기 배의 세포수를 조사한 결과, 내부세포괴세포수와 총세포수는 산소조건과 배양액간에 통계적인 유의성이 인정되지는 않았으나, 5% 산소조건에서 PZM-3 배양액(36.8±6.5개)이 다소 높은 총세포수를 나타냈다. 위의 결과를 종합하면 돼지체외수정란의 생산에는 5% 산소조건에서 PZM-3 배양액에서 배발달을 유도하는 것이 배반포기 발달률과 세포수에 있어 효과적이라고 판단된다.

본 연구는 돼지 난포란을 이용하여 생산된 1-세포기의 체외수정란을 NCSU-23, PZM-3 및 PZM-4의 세 가지 배양액과 서로 다른 산소농도를 부여하여 돼지 체외수정란의 적합한 체외배양조건을 구명하고자 실시하였다. 돼지 난포란의 체외성숙은 BSA가 미첨가 된 NCSU-23 배앙액에 10% pFF, 0.9 mM crysteine, 25 ㎍/㎖ β-mercaptoethanol 및 10 ng/㎖ epidermal growth factor와 호르몬(10 IU/㎖ PMSG, hCG)을 첨가하여 20∼22시간과 추가로 호르몬을 제거한 배양액에 20∼22시간을 배양하여 성숙을 유기하였고, 5∼6시간 동안 돼지 액상정액과 공배양함으로써 체외수정을 유기하였다. 체외수정 5∼6시간후 각각 5% 및 20%의 산소조건하의 NCSU-23, PZM-3 및 PZM4 배양액에서 배발달을 유기하였다. 돼지체외수정란을 체외배양하였을 때, 배발달 48시간에 처리구간 난할율에는 차이가 없었으나, 배양 7일째 배반포형성률은 5% 산소조건의 PZM-3 배양액에서 가장 높게 나타났다(19.9±2.4 vs. 11.1±2.0 to 16.0±2.5%, P<0.05). 그리고, 총세포수에 있어서 5%의 산소조건 하에서 배양하는 것이 20% 산소조건보다 유의적(P<0.05)으로 높았으나, 배양액간 차이는 인정되지 않았다. 따라서, 체외생산된 돼지초기수정란의 체외배발달은 5% 산소조건하의 PZM-3 배양액에서 배양하는 것이 좋은 것으로 나타났다.

The purpose of this study was to investigate the development of bovine nuclear transfer (NT) embryos cultured in serum-free conditions. Bovine NT embryos cultured in various culture conditions were compared blastocyst development, total cell number and apoptosis using TUNEL assay. In experiment 1, blastocyst rates of NT embryos were significantly higher (P<0.01) in FBS (22.0％) and BSA (26.6％) groups than in PVA (6.3％) group. Total cell number was significantly higher in FBS (78.4±19.4) and BSA (90.9±29.1) groups than in PVA group (46.0±0.0). Apoptotic cell number was significantly fewer in FBS (3.1±1.4) and BSA (1.7±1.4) groups than in PVA group (7.0±20.0) However, all of results were not different between the FBS and BSA group. In experiment 2, blastocyst rates of NT embryos were significantly higher (P<0.05) in fatty acid free-BSA (FAF-BSA) group (26.8％) than in fraction V-BSA group (11.2％). Total cell number were somewhat higher in FAF-BSA group (89.8±30.7) than in fraction V-BSA group (88.1±19.3). Apoptotic cell number were somewhat fewer in FAF-BSA (1.7±1.5) group than in fraction V-BSA group (4.2±2.9). These findings suggest that serum free condition were effective for the in vitro development of bovine NT embryos. Therefore, we concluded that fatty acid free-BSA has beneficial effect in development bovine NT embryos and can be use as a serum substitute.

DNA methylation at CpG sites, which is a epigenetic modification, is associated with gene expression without change of DNA sequences. During early mouse embryogenesis, dynamic changes of DNA methylation occur. In this study, DNA methylation patterns of porcine embryos produced in vivo and in vitro were examined at various developmental stages by the immunocytochemical staining method. Interestingly, active demethylation was not observed on the paternal pronucleus of porcine zygotes. However, differences were detected in the passive demethylation process between in vivo and in vitro embryos. There was no change in the DNA methylation state until the blastocyst stage of in vivo embryos, whereas partial demethylation was observed in several blastomeres from a 4 cell stage to a morula stage of in vitro embryos. The whole genome of inner cell mass (ICM) and trophectoderm (TE) cells in porcine blastocysts were evenly methylated without de novo methylation. Our findings demonstrate that genome-wide demethylation does not occur in pig embryos during preimplantation development unlike murine and bovine embryos. It indicates that the machinery regulating epigenetic reprogramming may be different between species.