Bacillus thuringiensis (B. t.) strains are important microorganism because they produced a large amount of δ-endotoxin protein per bacterial cell and their toxins are highly toxic to Lepidoptera, Coleoptera, and Diptera depending on B. t. To date, more than a hundred Cry proteins have been identified and classified into 195 holotypes, based on the amino acid sequence identity. The Cry proteins or cry genes from the Korean native B. t. isolates in this study were not identified yet. The electrospray ionization of quadrupole time of flight mass spectrometry (ESI Q-TOF MS) was used to get the internal amino acid sequences of the endotoxin-spore culture mixtures of B. t. isolates, for which polymerase chain reaction (PCR) techniques were unable to detect the cognate genes. Most of Cry proteins seperated, excized, and extracted from the one dimensional - polyacrylamide gel electrophoresis (1D-PAGE), instead of 2D-PAGE, were matched with protein databases using MS-MASCOT search program. The internal amino acid sequences which were submitted to protein BLAST (basic local alignment search tool) had partially homology with the Cry protein databases. Hence, present data strongly suggest that the de novo amino acid sequencing and ESI Q-TOF/MS analysis along with MASCOT search could be used as a simple and rapid method for detection of novel Cry toxins from B. t. isolates and identification of B. t. isolates.

해충에 대한 화학농약의 오남용으로 인하여 해충의 저항성이 발달되고 환경오염, 인축에 대한 위험 등의 이유로 화학농약의 사용을 줄이게 되었다. 그래서 친환경적인 방제인자인 미생물농약 Bacillus thuringiensis(이하 B.t)가 현재 전 세계적으로 널리 사용되고 있다. B.t는 그람 양성의 호기성 간균으로 토양, 곡물의 분진, 낙엽, 곤충의 사체등 다양한 곳에서 분리되는 것으로 알려져 있는데 본 연구에서는 풍뎅이류 곤충의 사체로부터 B.t를 분리하여 딱정벌레목 및 나비목 해충에 대한 생물활성 검정을 하여 살충활성이 우수한 균주를 선발하였으며 SDS-PAGE를 수행하였다. 파밤나방에 대한 생물활성 검정 결과, CAB530 균주는 처리 48시간 후에 90%가 넘는 사충률을 보여주었으나 CAB533 균주는 6%의 사충률을 보여주었다. 반면에 장수풍뎅이 유충과 배추벼룩잎벌레 성충에 대해서는 살충활성을 나타내지 않았다. SDS-PAGE 수행 결과 파밤나방에 살충활성이 있는 CAB530 균주는 B.t subsp. kurstaki와 비슷한 130kDa의 밴드를 나타냈으며 파밤나방 중장액으로 소화를 시킨 후에 약 65kDa의 밴드를 확인할 수 있었다. 파밤나방에 대해 살충활성이 적은 CAB533 균주는 65kDa의 독소단백질 밴드를 나타냈지만 파밤나방에 대해서 살충활성이 높지는 않았다.

파리목 모기과에 속하는 모기는 인간에게 질병을 매개하는 위생해충으로 세대기간이 짧으며, 번식력이 강한 특성을 가지고 있다. 인간에게 피해를 주는 모기에 대한 국내의 모기 방제는 대부분 성충을 대상으로 분무식 화학농약을 처리하였으나성충의 휴식 및 행동습성 그리고 정확한 서식처에 직접 접촉을 해야 방제효과를 얻을 수 있다는 점에서 방제에 어려움이 있다. 본 연구에서는 피해의 본질적인 원인이 되는 모기 유충을 대상으로 곤충 살충성 단백질을 생성하는 Bacillus thuringiensis(이하Bt)균주를 선발하여 친환경적인 모기 방제에 대한 실험을 수행하였다. 국내의 토양에서 Spherical type의 Crystal을 형성하는 19개 균주를 위상차 현미경으로 확인 후 모기에 가장 높은 활성을 보인 B.thuringiensis subsp. israelensis CAB191균주를 선발 대량배양하였다., 생물검정은 현재 시판중인 B.t.i 약제(B제품) 와 에스메토프렌을 주성분으로 하는 천연 식물성 테르페노이드 화합물인 약제(A제품)를 대조구로 사용하였다. 대상 해충은 이집트숲모기(Aedes aegypti), 이나도미집모기 (Culex inatomii), 지하집모기(Culex pipiens molestus)의 3령 유충으로 생물 검정을 수행하였다. CAB191균주와 B제품은 103cfu/ml에서 이집트숲모기, 이나도미집모기, 지하집모기에 90%이상의 높은 사충률을 보였다. 반면 A제품은 1,000배 희석액에서 48시간 후 검정시 10%정도의 사충률을 보였다. 이로써 CAB191균주와 B제품이 활성이 높음을 알 수 있었다. 또한 B.t.i와 B제품, CAB191, 대조 균주로 B.t.morrisoni의 단백질 패턴을 분석하기 위하여 SDS-PAGE한 결과 CAB191, B제품이 B.t.i와 동일한 130, 72, 27KDa의 밴드를 형성함을 알 수 있었다.

Bacillus thuringiensis 1-3 (Bt 1-3) which was isolated from a Korean soil sample showed high insecticidal activity against Aedes aegypti as well as Plutella xylostella. The isolate was determined to belong to ssp. aizawai (H7) type by an H antiserum agglutination test and produced bipyramidal-shaped crystal proteins with a molecular weight of 130 kDa. PCR analysis with cry gene specific primers showed that Bt 1-3 contained cry1Aa, cry1Ab, cry1C, cry1D and cry2A gene, differing from spp. aizawai (reference strain) which contains cry1Aa, cry1Ab, cry1C and cry1D. We modified the plasmid capture system (PCS) to clone plasmid from Bt 1-3 through in vitro transposition. Fifty-three clones were acquired and their sizes were approximately 10 kb. Based on the sequence analysis, they were classified according to similarities with four known Bt plasmids, pGI3, pBMB175, pGI1 and pGI2, respectively. One of pGI3-like clones, named as pBt1-3, was fully sequenced and its 20 putative open reading frames (ORFs), Rep-protein, double-strand origin of replication (dso), single-strand origin of replication (sso), have been identified. The structure of pBt1-3 showed high similarity with pGI3 which is one of rolling-circle replication (RCR) group VI family.

Through an application of plasmid capture system (PCS) to Bacillus thuringiensis plasmid DNAs, we acquired 21 polymorphic clones of putative genomic DNA of bacteriophage. The genome size of phage 1-3 (PhBT1-3) was determined to be 46,517 base pairs (bp) with 35.43% G + C content and 83% coding region. Sixty-five putative open reading frames (ORFs) with more than 50 codons were found in the new phage genome. In accordance with this genome finding, the phage particles and its DNA were confirmed from the supernatant of B. thuringiensis 1-3. Morphological characterization and infectivity assay demonstrated that PhBT1-3 belongs to the family Siphoviridae and it showed infectivity to three B. thuringiensis type strains, galleriae, entomocidus, and morrisoni. Based on these results, we screened the existence of phages in B. thuringiensis type strains by PCR with terminase small subunit-specific primers. Ten of 67 type strains showed PCR products and the similarity of those putative amino acids was more than 70%. Furthermore, we verified the existence of various shaped phages from the supernatants of 10 B. thuringiensis type cultures. In conclusion, we characterized a putative genome of phage, PhBT1-3 from B. thuringiensis 1-3, and confirmed the distribution of phages in the group of 67 B. thuringiensis type strains.

A new Bacillus thuringiensis isolate 19-22 (Bt 19-22) exhibited high anti-fungal activity against barley powdery mildew (Blumeria graminis f. sp. hordei). The cry gene content of Bt 19-22 comprised cry1Aa, cry1Ab, cry1Ac and cry1D which have high insecticidal activity against lepidopteran larvae. We tried to confer a dipteran insecticidal activity to Bt 19-22 for constructing a recombinant strain which has multiple functions, anti-fungal and dual insecticidal activity. The insecticidal cry11Aa gene of B. thuringiensis was constructed under cry1Ac promoter in an E. coli-B. thuringiensis shuttle vector (pPro11A). The plasmid, pPro11A was introduced into Bt 19-22 isolate by electroporation and four transformants which had different cry gene contents were identified by PCR with cry11Aa and cry1-type specific primers. Among them, a Bt 19-22 transformant (11A/19-22 No. 7) expressed Cry11A protein (approximately 70 kDa) successfully without change of its inherent characteristics such as Cry protein expression and antifungal activity. The insecticidal activity of 11A/19-22 No. 7 was checked against Plutella xylostella and Culex pipiens. These results suggests that the recombinant strain shows dual insecticidal activity against lepidopteran and dipteran larvae as well as antifungal activity.

Bacillus thuringiensis(B.t.)는 해충방제용으로 가장 많이 사용되고 있는 미생물제이며, 배추재배 농가현장에서 B. thuringiensis를 제형화한 미생물 살충제와 함께 배추 병 방제를 위하여 화학살균제를 사용하고 있다. B. thuringiensis의 미생물 살충제를 안정적으로 사용하기 위하여 이들 농약과 B. thuringiensis간의 상호작용을 규명하고 혼용 및 교호살포하기에 적절한 농약을 선발하기 위하여 본 연구를 수행하였다. 현재 유통되고 있는 B. thuringiensis 살충제 7종에 대하여 수행되었으며, 화학살균제는 배추에서 노균병과 무름병에 등록되어 있는 코퍼하이드록 사이드 수화제 등 12종을 대상으로 수행하였다. 추천농도의 화학농약을 첨가한 TSA배지에 대상미생물살충제를 도말하여 형성된 콜로니를 비교하였으며, 대상 미생물살충제 7종과 화학살균제를 각각 추천농도로 혼합하여 30분 shaking 한 후 배추 잎침지하여 배추좀나방에 대한 살충력을 petri-dish에서 조사하였다. 7종의 B. thuringiensis 살충제는 화학농약을 함유한 배지에서의 B. thuringiensi의 콜로니는 옥시테트라사이클린 수화제, 스트렙토마이신 수화제, 발리다마이신에이 수화제, 옥솔린산 수화제를 함유한 TSA배지에서 콜로니가 형성되지 않았다. 미생물 살충제와 화학살균제의 혼합액을 배추좀나방에 처리한 결과 5종의 B. thuringiensis 살충제(TB-WP, SC, SB, BG)는 12종의 화학살균제의 혼합에 따른 살충력에 차이가 없었으나, TB-SO와 플루오피콜라이드 ․ 프로파모카브하이드로 클로라이드 액상수화제, TH와 코퍼하이드록사이드 수화제의 혼합액처리에서 배추좀나방의 살충력이 유의하게 감소하는 결과를 보였다.

Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki KB100 isolated from the domestic soil have the most effective activity against the beet armyworm, Spodoptera exigua larva. The tannic acid as protease inhibitor might be increased the efficacy of sublethal concentrations of B. thuringiensis. The tannic acid was identified as a protease inhibitor that could increased the efficacy of sublethal concentrations of B. thuringiensis. Mixture of B. thuringiensis and tannic acid was investigated the mortality of S. exigua larva in the laboratory and field. When B. thuringiensis treated to 2nd larva of S. exigua, mortality was shown 54.4%. However, mixtures of B. thuringiensis with 4 and 40 mM tannic acid were increased mortalities to 2nd larva of S. exigua as 64.0 and 95.5%, respectively. Also, synergy effect of mixture of B. thuringiensis and 40 mM tannic acid was increased the mortality of S. exigua 3rd larva to 93.3%, even though 60.0% mortality with only B. thuringiensis treatment. On the other hand, the mortality of mixture with B. thuringiensis and 80 mM tannic acid was 53.3% lower than B. thuringiensis single treatment. In the welsh onion field, the accumulated mortalities of 3 times replicated with mixture of B. thuringiensis and 40 mM tannic acid were 83.9, 89.4 and 66.8% compare with 61.8, 80.4 and 47.3% as only B. thuringiensis treatment, respectively.

Bacillus thuringiensis subsp. aizawai CAB109 isolated in Korea is known active against Spodoptera sp.. Especially, B. thuringiensis aizawai CAB109 isolates showed 100% mortality against Spodoptera litura and Spodoptera exigua. To screen highly active B. thuringiensis, the pathogenicity of B. thuringiensis CAB109 was compared with that of commercialized B. thuringiensis products. LC₅₀ values of CAB109, product TB-WP and product SC strains of B. thuringiensis were 1.3x10⁵, 2.3x10⁶ and 5.2x10⁵ cfu/㎖ against the 2nd larva of S. litura and 1.8×10⁴, 1.3×10⁶ and 1.5×10⁶ cfu/㎖ against the 2nd larva S. exigua, respectively. To determine new gene"s existence and absence, the plasmid DNA was extracted, and compared to that of B.t. aizawai HD-133. Both B. thuringiensis were not like plasmid DNA pattern. PCR technique was used to predict both plasmid DNA"s cry gene. PCR products analysis showed that B.t. CAB109 harbor Cry1Aa, Cry1Ab, Cry1C and Cry1D and B.t. HD-133 has Cry1Aa and Cry1Ab, respectively.

파밤나방은 파, 배추, 수박 등에 다 발생하여 큰 피해를 주는 대표적인 농업 해충이며 화학농약에 대한 저항성이 강한 대표적인 해충으로, 본 연구에서는 생물적 방제인자로 방제하고자 Bacillus thuringiensis(이하 Bt) 균주를 선발하여 살충효과를 검정 하였다. 파밤나방의 살충효과검정에서 내성이 강한 해충과 비슷한 양상으로, 나비목 해충과 다르게 Bt에 대한 살충활성이 늦게 나타나는 지효성을 나타냈다. 이러한 원인으로 유충 중장 프로테아제에 의해 Bt의 cry 독소가 과분해 되는 것으로 가정하고 protein inhibitor로 알려져 있는 tannic acid를 선발하여 실내 실험과 야외 포장 실험을 수행하였다. 그 결과 Bt 단독처리보다 Bt와 tannic acid를 혼합처리 했을 때 더 높은 사충율을 나타냈다. 이 같은 결과에 대해 원인을 규명하고자, 가설을 세워 실험을 수행 하였다. 중장 프로테아제가 130kDa의 불활성 독소를 60kDa의 활성 독소로 분해한 후, 더 과분해 하는 것을 tannic acid가 억제할 것이다 라고 가설을 세운 후 실험을 수행 하였다. SDS-PAGE를 하여 tannic acid의 억제정도를 확인했고, 이 결과를 토대로 40mM tannic acid를 전 처리 한 후 Bt처리를 한 결과 동시처리보다 약 5% 더 높은 사충율을 나타냈다. Bt와 중장 프로테아제, tannic acid의 반응에 있어서 형태적인 면을 확인하기 위해 전자현미경을 관찰 하였다. 중장 프로테아제의 증명을 위해 자이모그램 실험을 수행 하였다.

A bee-vectoring method has been recently developed against greenhouse insect pests. In this study, we conducted experiments to determine if bumble bees, bombus terrestris L. could vector Bacillus thuringiensis subsp. aizawai from hives equipped with a pathogen dispenser to leaf and flower of sweet pepper. First, in laboratory, insecticidal activity of B. t. subsp. aizawai NT0423 WP (Tobagi, Dongbu Hitek Co.) against 2nd instar larva of Spodoptera litura Fabricius was evaluated to determine if the amount of B. thuringiensis deposited on the leaf and flower would be sufficient to control the tobacco cutworm. The B. t concentration of the product in this experiment was estimated as 2.8-3.1 x 109 CFU/ml. The B. t. concentration on the body of bumble bees that was captured as they exited hives with filled pathogen dispensers was 4.6 x 109 cfu/ml. At the laboratory bioassay, the mortality of tobacco cutworm was serially measured depending on the pathogen concentrations. At the cage trials, the B. t. delivered by bumble bees was detected in bees, flowers and leaves. Through the several trials, the control effect on the tobacco cutworm has been investigating. The side effect on bumble bee from the first trial was not found in this experiment.

국내에서 분리된 Bacillus thuringiensis subsp. aizawai CAB109균주는 나비목 해충에 활성을 보이는 것을 확인 하였다. 특히 우리나라에서 난방제 해충으로 알려진 담배거세미나방과 파밤나방에 동시에 독성을 보이는 것으로 나타났다. B.t. CAB109 균주의 활성정도를 비교하기 위해 혈청형이 aizawai이면서 생물농약으로 시판중인 T제품과 S제품을 조사한 결과, B.t. CAB109, T제품, S제품은 담배거세미나방 2령충에 대한 반수치사농도(LD50)가 각각 1.3x105cfu/ml, 2.3x106cfu/ml, 5.2x105cfu/ml으로 나타났고 파밤나방 2령충에 대한 반수치사농도는 1.8x104cfu/ml, 1.3x106cfu/ml, 1.5x106cfu/ml으로 나타나 두 종 해충 모두에서 B.t. CAB109 균주가 독성이 더 높은 것을 볼 수 있었다. B.t. CAB109가 이미 알려져 있는 aizawai와 비교해 새로운 유전자를 소유하는지 확인하기 위해 Plasmid DNA를 추출하여 전기영동 한 결과 B.t. subsp. aizawai HD-133과 다른 패턴을 보이는 것을 확인 할 수 있었고 Cry1~Cry5의 primer를 사용하여 PCR을 진행한 결과 B.t. subsp. aizawai CAB109균주는 Cry1Aa, 1Ab, 1C, 1D를 B.t. subsp. aizawai HD-133은 Cry1Aa, 1Ab를 가지고 있음을 확인 할 수 있었다. Plasmid DNA의 여러 밴드에서 어떤 부분이 해충에 어떠한 영향을 미치는지 확인하기 위해 B.t.가 생장하기 어려운 조건을 만들어 배양한 결과 이전과 다른 B.t. 내독소단백질을 가지고 있지 않은 strain을 만들 수 있었다. 이두 CAB109 strain의 플라스미드 DNA를 확인한 결과 밴드의 차이를 확인할 수 있었다. 그리고 Cry- strain은 모 stain이 가지고 있는 Cry gene을 가지고 있지 않음을 확인 할 수 있었고 생물 활성결과 독성을 보이지 않음을 확인하였다. 이후 다른 B.t. CAB109가 다른 Cry gene을 가지고 있는지에 대한 PCR을 더 진행할 예정이며 새로운 Cry gene여부에 대한 연구도 더 진행해나갈 계획이다.

Bacillus thuringiensis 1-3 (Bt 1-3), belonging to subsp. aizawai (H7), showed different characteristics in plasmid profiles from type strain and had cry2A gene in addition to cry1Aa, cry1Ab, cry1C and cry1D. To clone its plasmids and construct E.coli-Bt shuttle vector, we constructed the plasmid capture system (PCS) by inserting attB sites including lacZ between transposable elements (designated as pPCS-Troy). Through in vitro transposition with total plasmids DNA of Bt 1-3, 53 clones were acquired and their sizes were approximately 10 kb. Based on the sequence analysis, they were classified in four groups showing similarities with four known Bt plasmids, pGI3, pBMB175, pGI1 and pGI2, respectively. One of pGI3-like clones, named as pBt1-3, was fully sequenced and its putative open reading frames (ORFs), Rep-protein, double-strand origin of replication (dso), single-strand origin of replication (sso), have been identified. The structure of pBt1-3 showed high similarity with pGI3 which is one of rolling-circle replication (RCR) group VI family. As a donor for construction of shuttle vector, pDonr-attPEm vector harboring erythromycin resistant gene between attP sites was constructed. Through BP recombination with pPCS-Troy-cloned Bt plasmids and pDonr-attPEm, erythromycin resistant gene was transposed to Bt plasmids. This scheme proposes that in vitro transposition using pPCS-Troy and BP recombination using pDonr-attPEm can easily clone Bt plasmids and construct novel shuttle vectors.

Bacillus thuringiensis, an entomopathogenic bacterium belonging to the B. cereus group, harbors numerous extra-chromosomal DNA molecules whose sizes range from 2 to 250 kb. In this study, we used a plasmid capture system (PCS) to clone three small plasmids from B. thuringiensis subsp. kurstaki K1 using PCS which were not found in B. thuringiensis subsp. kurstaki HD-1, and determined the complete nucleotide sequence of plasmid pK1S-1 (5.5 kb). Of the six putative open reading frames (ORF2-ORF7) in pK1S-1, ORF2 (MobK1) showed approximately 90% aa identity with the Mob-proteins of pGI2 and pTX14-2, which are rolling circle replicating group VII (RCR group VII) plasmids from B. thuringiensis. In addition, a putative origin of transfer (oriT) showed 95.8% identity with those of pGI2 and pTX14-2. ORF3 (RepK1) showed relatively low aa identity (17.8-25.2%) with the Rep protein coded by RCR plasmids, however. The putative double-strand origin of replication (dso) and single-strand origin of replication (sso) of pK1S-1 exhibited approximately 70% and 64% identities with those of pGI2 and pTX14-2. ORF6 and 7 showed greater than 50% similarities with alkaline serine protease, which belongs to the subtilase family. The other 2 ORFs were identified as hypothetical proteins. To determine the replicon of pK1S-1, seven subclones were contructed in the B. t huringiensis ori-negative pHT1K vector and were electroporated into a plasmid cured B. thuringiensis strain. The 1.6 kb region that included the putative ORF3 (Rep1K), dso and ORF4, exhibited replication ability. These findings identified pK1S-1 as a new RCR group VII plasmid, and determined its replication region.

분리된 Bacillus thuringiensis subsp. aizawai CAB109균주는 나비목 해충에 활 성을 보이는 것을 확인 하였는데 특히 우리나라에서 난방제 해충으로 알려진 담배거세미나방과 파밤나방에 동시에 독성을 보이는 것으로 나타났다. B.t. CAB109 균주의 활성정도를 비교하기 위해 혈청형이 aizawai이면서 생물농약 으로 시판중인 T제품과 S제품을 조사한 결과, B.t. CAB109, T제품, S제품은 담배거세미나방2령충에 대한 반수치사농도가 각각 1.3×105cfu/ml, 2.3×106cfu/ml, 5.2×105cfu/ml으로 나타났고 파밤나방2령충에 대한 반수치사농도는 1.8×104cfu/ml, 1.3×106cfu/ml, 1.5×106cfu/ml으로 나타나 두 종 해충 모두에서 B.t. CAB109 균 주가 독성이 더 높은 것을 볼 수 있었다. B.t. CAB109가 이미 알려져 있는 aizawai와 비교해 새로운 유전자를 소유하 는지 확인하기 위해 Plasmid DNA를 추출하여 전기영동 한 결과 B.t. subsp. aizawai HD-133과 다른 패턴을 보이는 것을 확인 할 수 있었고 Cry1-Cry5의 primer를 사용하여 PCR을 진행한 결과 B.t. subsp. aizawai CAB109균주는 Cry1Aa, 1Ab, 1C, 1D를 B.t. subsp. aizawai HD-133은 Cry1Aa, 1Ab를 가지고 있음을 확 인 할 수 있었다. 이후 다른 B.t. CAB109가 다른 Cry gene을 가지고 있는지에 대한 PCR을 더 진행할 예정이며 새로운 Cry gene여부에 대한 연구도 더 진행해나갈 계획이다

독성과 직접 관계가 있는 외에 곤충의 섭식 량과도 관계됨으로 식물 잎에 Bt 가 많이 전착되어 있어야 높은 방제효과를 기대할 수 있다. 따라서 본 연구는 Bt제에 계면활성제인 Tween80을 첨가하여 식물 잎에 많이 전착하도록 시도함 과 아울러 방제효과를 상승시키고자 시행되었다. 연구결과 B. thuringiensis CAB109균주에 Tween80의 2,000배 희석액을 첨가하여 파 잎에 살포하면 전착 율을 8.0배 증가할 수 있었고, 1,000배로 희석하여 살포하면 Bt균의 잔효기를 7일에서 14일로 연장할 수 있었다. 식물에 따라 전착효과를 검정한 결과 파, 옥수수, 케일 등은 전착율이 모두 7배 이상에 달하여 약물이 전착하기 상당히 어려운 식물들이었다. 비록 식물에 따라 다르지만 상품화된 Bt제도 Tween80 의 1,000배 희석액을 첨가하면 전착율이 3-6배가량 높아 졌다. 그리고 B.thuringiensis CAB109균주에 Tween80을 1,000배 희석하고 첨가하여 살포한 결과, 파 포장에 서 파밤나방의 살충율과 피해주감소율을 각각 28.9%와 8.6%를 상승시킴으로 서 특히 약물이 전착하기 어려운 식물에서 Bt제에 대한 Tween80의 이용 잠재 력을 과시하였다.

배추좀나방은 비닐하우스 등 시설재배가 늘어남에 따라 십자화과 채소의 연중재배가 이루어지면서 경제적인 피해가 심한 농작물 해충 중 하나이다. 이 해충은 세대기간이 짧고 화학농약의 집중살포로 인해 저항성이 빠르게 발달 되어 방제가 어렵고 미생물제제인 B.t에 대해서도 저항성이 보고되고 있는 실 정이다. 최근 이러한 문제해결과 친환경적 방제를 위하여 천적의 이용이 증가 하고 있지만, 천적과 미생물제제를 동시에 이용하여 종합적 해충방제를 하기 위한 시도들과 그에 따른 방제효과에 대한 정보들이 미흡한 실정이다. 따라서 배추좀나방 방제를 위해 이용되는 천적인 조명알벌의 기생율과 국내에서 시 판중인 B.t 약제의 혼합 처리시 방제효과에 대한 기초 자료를 얻고자 실험을 실시하였다. 배추좀나방에 이용되고 있는 천적 중 알에 기생하는 조명알벌과 B.t 생물농 약 T제품을 투입시기를 달리하여 처리 후 조명알벌의 기생율과 배추좀나방 유충 생존율, 피해엽수 등을 조사하여 각각의 처리와의 방제효과를 비교하고 자 하였다. B.t 약제를 처리 후 천적을 투입하였을 때 이전보다 좋은 방제효과 를 나타내었는데, 이와같이 혼합처리를 통한 배추좀나방 모든 발육단계의 동 시방제를 통하여 보다 효과적이고 안정적인 친환경방제를 할 수 있을 것으로 기대된다. 추후 대표적인 농업해충인 파밤나방과 거세미나방에 대한 조명알벌 의 기생율과 배추 포장실험을 통하여 보다 효과적인 방제방법을 연구할 계획 이다.

B.t가 분비하는 외독소를 이용하며 동시에 병해충방제를 조사하기 위하여 식물의 주요병원균인 Alternaria Panax(인삼점무늬병), Botrytis cineria(잿빛곰팡 이병), Colletotrichum gloeosporioodes(탄저병), Fusarium oxysporum(시들음병)에 대한 생장억제효과를 확인하였다. B.t 균주를 액체배지인 LB배지에 배양하고 원심분리(4℃, 12000rpm)를 한 후 상청액만을 이용하였는데, PDA배지에 각각 의 식물병을 접종하고 주위를 둘러 디스크를 올리고 그 위에 상청액을 접종 하였다. 접종한 PDA 배지를 25℃ 배양기에 약 10~14일 정도를 배양하고 결과 를 확인 한 결과 실험실에 보유하고 있는 B.t 균주 중에서 93균주에 대해서 억제작용이 있는 것으로 나타났으며 A. panax에 효과가 있는 균주가 64균주로 68%나타났고, B. cineria에 효과가 있는 균주가 3균주로 3%, C. gloeosporioodes 에 효과가 있는 균주는 24균주로 4%, F. oxysporum에 효과가 있는 균주는 10 균주로 전체 생장억제효과를 스크리닝한 93개 균주중 10%의 균주가 위의 4종 의 식물병원균의 생장억제를 보이는 것으로 확인되었으며, 이러한 B.t 외독소 를 이용한 식물병원균의 방제효과 가능성을 검토할 계획이다

파밤나방은 파, 배추, 수박 등에 다발생하여 큰 피해를 주는 대표적인 농업 해충이며 화학농약에 대한 저항성이 강한 대표적인 해충으로, 본 연구에서는 생물적 방제인자로 방제하고자 Bacillus thuringiensis(이하 Bt) 균주를 선발하여 살충효과를 검정 하였다. 파밤나방은 살충효과검정과정에서 내성이 강한 해충과 비슷한 양상으로, 다른 나비목 해충과 다르게 Bt에 대한 살충활성이 늦게 나타나는 지효성을 나타냈다. 이러한 원인으로 유충 중장의 프로테아제에 의해 cry 독소가 과분 해 되는 것으로 가정하고 protein inhibitor로 알려져 있는 tannic acid를 선발하 여 실내 실험과 야외 포장 실험을 수행하였다. 그 결과 Bt 단독처리보다 Bt와 tannic acid를 혼합처리 했을 때 더 높은 사충율을 나타냈다. 이 같은 결과에 대해 원인을 규명하고자, 몇 가지 가설을 세워 실험을 수행 하였다. 첫 번째 tannic acid가 Bt균 자체에 영향을 미치는 영향을 확인 하기 위해, Nutrient Agar(NA)배지에 tannic acid를 처리했을 때, Bt균의 생장여부와 생장정도를 확 인하고, 중장액과 Bt, tannaic acid를 각각 또는 혼합처리 했을 때의 중장내 Bt crystal의 형태적 변화를 관찰하기 위해 주사전자현미경 관찰을 수행 하였다. 두 번째로 중장 프로테아제가 130kDa의 불활성 독소를 60kDa의 활성독소로 분해한 후, 더 과분해 하는 것을 tannic acid가 억제할 것이라는 가설을 증명하 기 위해 SDS-PAGE를 수행하여 tannic acid의 억제정도를 확인했고, 이 결과를 토대로 40mM tannic acid를 전처리 한 후 Bt처리를 했을 때, 동시처리보다 약 5% 더 높은 사충율을 나타냈다.

Bacillus thuringiensis 1-3 (Bt 1-3), belonging to subsp. aizawai (H7), showed different characteristics in plasmid profiles and had cry2A gene in addition to cry1Aa, cry1Ab, cry1C and cry1D. This strain exhibited dual insecticidal activity against Aedes aegypti as well as Plutella xylostella. Recently, we improved the donor-s of plasmid capture system (PCS) by inserting attB sites including lacZ between transposable elements (designated as pPCS-Troy), to construct E.coli-Bt shuttle vector. Through in vitro transposition with total plasmids DNA of Bt 1-3, 53 clones were acquired and their range of sizes were approximately 10 kb. Based on the sequence analysis, they were classified in 4 groups showing similarity with 4 known plasmids, pGI1, pGI2, pGI3 and pBMB175, respectively. One of pGI3-like clones was fully sequenced and its open reading frames were analyzed. As a donor for construction of shuttle vector, pDonr-attPEm vector harboring erythromycin resistant gene between attP sites was constructed. Through BP recombination with pPCS-Troy-cloned Bt plasmids and pDonr-attPEm, erythromycin resistant gene was transposed to Bt plasmids. This scheme proposes that in vitro transposition using pPCS-Troy and BP recombination using pDonr-attPEm can easily construct novel shuttle vectors with any Bt plasmids and this combined procedure can introduce foreign gengs into various circular DNA molecular.