In this study, we investigated the possibility of using mouse embryonic stem cell conditioned medium (ESCM) and embryonic stem cell medium (ESM) for in vitro maturation in the efficient in vitro production of blastocysts from porcine follicular oocyte. Depending on the concentration of supplement of ESCM added to the NCSU-23 solution did not affect 2-cell development rates and blastocysts development. However, in particular, the survival rate (10 days of culture) of blastocyst was significantly higher than that of the control group as the additive concentration (30%) increased (p < 0.05). The survival rate of blastocysts showed a similar tendency even with addition of ESM (30%) alone. On the other hand, the duration of the addition of these additives during IVM (0-44 h) was that the IVM I period (0-22 h) were more effective than the IVM II period (22-44 h). Thus, the effect of these additives is probably due to the combination of the various physiologically active substances of ESCM or the appropriate amino acids and vitamins of ESM. In particular, these additives were more effective during the first half (IVM I) of in vitro maturation. In summary, optimization of ESCM or ESM supplementation may improve in vitro maturation of porcine oocyte and affect developmental competency. Therefore, if more efficient methods of adding ESCM or ESM to basal culture medium can be developed during in vitro maturation of porcine follicle oocytes, high quality blastocysts will be developed from low porcine follicular oocyte compared to other domestic animals.

본 연구는 혈통이 확인된 한우 암소의 체중과 월령에 따라 난소에서 난포의 분포 양상을 확인하고, 체외성숙배양 배지가 채취된 미성숙 난자/난구세포의 배양시 분할율에 미치는 영향을 확인하고자 수행하였다. 도축장에서 도축된 암소들의 혈통, 생체중, 및 월령을 기준으로 적출된 난소를 분류한 후, 난소 모양, 황체, 백체 및 난포액 분포 양상을 확인하였고, 개체별 한우 난소에서 18G 주사침이 장착된 5ml 주사기를 이용하여 난자를 채취한 후, 실체현미경으로 관찰하여 난구세포가 난자주변을 둘러싸고 있는 난자를 회수 하였다. 회수한 미성숙난자를 25mM HEPES 와 10% FBS 가 첨가된 TCM-199 으로 옮겨 2~3 회 세정한 후, follicle stimulating hormone(FSH, Sigma) 0.5 μg/ml, luteinizing hormone(LH, Sigma) 0.5μg/ml, β-estradiol(Sigma)1μg/ml 가 첨가된 미성숙 난자의 체외성숙배지 BO, TCM199, 및 IVMD101 를 각각 사용하여 22 시간 동안 38.5℃, 5% CO2 배양기에서 성숙시켰다. 동결정액은 동일한 보증씨수소 정액을 37.5℃에서 30 초간 융해 하였으며, 최종 정자에는 IVF100 을 첨가하여 각각의 정자 droplet 에 난자들을 38.5℃, 5% CO2 조건의 배양기에 5~6 시간동안 체외수정 하였다. 연구 결과, 무혈통 번식 한우의 체외성숙 배지별 분할율은 BO 배양액에서 23.99%였고, TCM199 에서 47.99%, IVMD101 에서 40.04%로, BO 가 가장 낮았고 TCM199 가 높은 경향을 나타냈다. 개체별 체중에 따른 난자의 체외성숙 배지별 분할율은 480kg 미만의 경우, TCM199 에서 72.73%였고, IVMD101 에서 33.77%로 TCM199 이 월등히 높았다. 480-639kg 의 경우, TCM199 에서 50.05%였고, IVMD101 에서 55.11%로 IVMD101 가 높았으나 비슷한 양상을 나타냈다. 640-699kg 의 경우는 TCM199 에서 65.38 %였고, IVMD101 에서 47.92%로 TCM199 가 높았으며, 700kg 이상의 경우에는 TCM199 에서 61.75%, IVMD101 에서 55.63%로 TCM199 가 더 높게 나타났다. 개체별 월령에 따른 난자의 체외성숙 배지별 분할율은 39 개월 미만의 경우, TCM199 에서 62.41%, IVMD101에서 50.00%로 TCM199 이 높았고, 39-50 개월미만의 경우에는 TCM199 에서 51.22%, IVMD101 에서 49.89%로 TCM199 이 더 높은 경향을 보였다. 50 개월 이상의 경우에는 IVMD101 에서 57.40%로 TCM199 에서 52.25%보다 높게 나타났다. 결과적으로 체중별로 채취된 난자는 TCM199 에서 분할율이 높았으며, 월령별로 채취된 난자는 50 개월이상의 경우 IVMD101 에서 분할율이 높았으나 39-50 개월미만과 39 개월미만의 경우 TCM199 에서 분할율이 높아 다른 경향을 보였다. 본 연구결과를 바탕으로 체중, 월령 및 배양 배지에 따라서 분할율의 향상과 이때 발현되는 번식형질 유전자의 발현에 관한 연구가 필요할 것으로 사료된다.

Hyaluronan은 난포액, 나팔관과 자궁에 존재하는 물질로 돼지의 다정자 수정을 억제하고 체외배 양액에 첨가시 배 발육을 향상시키는 것으로 알려져 있다. Glucuronic acid와 N-acetyl-D-glucosamine (GlcNAc)은 이중결합하여 hyaluronan을 구성하는 물질이다. 본 연구에서는 체외성숙 배양액 내 Glucuronic acid 및 GlcNAc 첨가가 돼지 난자의 성숙 및 단위발생 난자의 배 발육에 미치는 영향 을 조사하였다. 난자의 체외성숙 배양액으로는 0.1% PVA (polyvinyl alcohol)가 첨가된 Medium-199 을 기본배양액으로 이용하였고, 여기에 cysteine, pyruvate, epidermal growth factor, kanamycin, insulin 및 호르몬을 추가하여 44시간 동안 난자를 배양하여 체외성숙을 유도하였다. 실험설계에 따라 glucuronic acid 및 GlcNAc를 각각 0, 0.005, 0.01, 0.05, 0.1 mM의 농도로 체외성숙 배양액에 첨가 하였다. 체외성숙된 난자는 전기자극을 통해 단위발생을 유도하였고 porcine zygote medium-3에서 7일간 체외 배양하였다. 실험 결과 난자의 체외성숙 배양액 내 glucuronic acid 첨가는 난자의 핵 성숙률(91.3-94.4%), 단위발생 후 분할률(85.5-93.6%) 및 배반포 발달율(42.0-51.0%)에 영향을 미치지 않았으나 배반포 세포수는 0.05 mM glucuronic acid 첨가 군에서 38.0개로 대조군의 31.5개에 비해 유의적으로(P<0.05) 증가하였다. 난자의 체외 성숙 배양액에 GlcNAc를 첨가하였을 때 난자의 핵 성숙률(94.3-97.2%) 및 단위발생 후 배반포 세포수(40.0-43.1)는 대조군 및 첨가 농도의 차이에 따라 유의적인 차이를 보이지 않았으나 분할률은 0.05 mM 처리군에서 91.8%로 대조군(85.0%) 및 0.005 mM 처리군(84.6%)에 비해 유의적(P<0.05)으로 증가하였다. 또한 0.05 mM 처리군의 배반포 발달 율은 59.6%로 대조군(46.3%), 0.005 mM 처리군(44.3%) 및 0.1 mM 처리군(45.2%)에 비해 유의적으 로 높았다. 이상 결과로 보아 체외성숙 배야액 내 0.05 mM glucuronic acid 및 GlcNAc 첨가는 돼 지 난자의 단위발생 후 배 발육을 증가시키는 것으로 사료된다.

Monosodium glutamate (MSG)는 아미노산의 일종인 글루탐산에 나트륨이 결합된 것으로 구수한 맛, 감칠맛을 내는 인공조미료로 사용되고 있다. 이전 연구에 의하면 쥐에서MSG의 섭취가 난모세 포의 발달에 유해하다는 결과가 보고되었다. 본 연구에서는 돼지 난자의 체외성숙 및 체외 배양액 에 MSG 첨가가 난자의 성숙 및 배 발육에 미치는 영향을 검토하였다. 난자의 체외성숙배양액으 로는 10% 돼지 난포액이 첨가된 Medium-199 (positivecontrol) 또는 비필수아미노산이 제거된 Porcine zygote medium (PZM)-4를 기본배양액으로 하여 여기에 cysteine, pyruvate, epidermal growth factor, kanamycin, insulin 및 호르몬을 첨가하여 사용하였다. 실험설계에 따라 MSG를 각각 0, 0.1, 1, 10 mM 농도로 체외성숙 배양액에 첨가하였다. 체외성숙 난자는 전기자극을 통해 단위발생을 유도하였고 PZM-3배양액에서 7일간 체외 배양하였다. 체외배양에서의 MSG 효과를 알아보기 위하 여 돼지 난포액 첨가 Medium-199에서 체외성숙된 난자들 중 제1극체가 방출된 난자만을 선별하여 단위발생 유도 후 PZM-3 (positive control) 또는 비필수아미노산이 제거된 PZM-4에 0,0.1, 1, 10 mM의 MSG를 첨가하여 배 발육에 미치는 영향을 조사하였다. 체외성숙 단계에서 MSG 효과를 조 사한 결과 MSG 농도에 따른 체외성숙률(61.3-70.3%)에는 차이를 보이지 않았지만 10 mM의 MSG 처리군(83.5%)이 0.1 mM 처리군(93.7%)에 비해 유의적으로 낮은 분할률을 보였다. 또한 MSG 처리 군들이 (14.5-25.5%) 무처리군(30.0%)에 비해 낮은(P<0.05) 배반포 발달률을 보였다. 체외배양 단계 에서 MSG 효과를 조사한 결과 10mM MSG 처리군(90.8%)이 1 mM 처리군(96.5%)에 비해 유의적 으로 낮은 분할률을 보였으며, 10 mM 처리군(32.8%)이 0.1과 1 mM MSG 처리군에(55.1, 51.4%)에 비해 유의적으로(P<0.05) 낮은 배반포 발달률 보였으나 무처리 대조군(46.6%)과 유의적 차이는 없 었다. 이러한 결과를 보아 체외성숙 배양액 내 MSG 첨가는 난자의 핵 성숙률에는 영향을 주지 않지만 고농도의 MSG 처리는 단위발생 후 분할률을 억제하며 배반포 발육능을 억제하는 것으로 확인되었다.

돼지 난자의 체외배양 과정에서 배양액의 삼투압의 차이 및 glycine과 alanine 단독 또는 병행 첨 가가 단위발생 및 체세포 핵이식 난자의 배 발육에 미치는 영향을 검토하였다. 난자 의 체외성숙 에는 10% 돼지 난포액, cysteine, pyruvate, epidermal growth factor, kanamycin, insulin이 첨가된 TCM-199을 이용하였다. 체외성숙 42∼44시간 후 제1극체가 방출된 난자만을 선별하여 단위발생 및 체세포 핵이식 난자를 생산한 후 modified porcine zygote medium (mPZM)-3 배양액에서 7일간 배양하였다. 실험 설계에 따라 체외배양 7일 또는 체외배양 초기 48시간 동안 280 또는 320 mOsm의 삼투압에서 난자를 배양하였다. 실험1에서 체외배양 7일 동안 280 또는 320 mOsm의 배 양액 내 glycine 또는 alanine 첨가 효과를 검토한 결과 삼투압 차이에 따른 분할률 및 배반포 발달 률에는 차이를 보이지 않았으나 320 mOsm에서 배양된 난자 및 280 mOsm에 glycine을 첨가한 군 은 280 mOsm에서 배양된 난자에 비해 높은 배반포 세포수를 보였다 (36.5-38.0 vs. 31.1, P<0.05). 실험2에서는 체외배양 초기 48시간 동안 280 또는 320 mOsm의 삼투압에서 배양하였고, 그 후 280 mOsm 배양액으로 옮겨 5일간 추가로 배양하였다. 또한 체외배양액 내 4.1 mM glycine 첨가가 배 발육에 미치는 효과를 검토하였다. 단위발생 난자를 배양초기 48시간 동안 320 mOsm에서 glycine이 첨가된 배양액에서 배양한 군이 280 mOsm에서 배양한 군에 비해 유의적으로 높은 배반 포 발달율을 보였다(36.5-50.4% vs. 25.9-27.9%, P<0.05). 또한 배양 초기 48시간 동안 320 mOsm 배 양액에 glycine을 첨가하여 배양한 난자 (50.4%)가 다른 처리군의 난자(25.9-36.5%)에 비해 유의적 으로 높은 배반포 발달율을 보였다(P<0.05). 실험3에서는 실험2와 동일한 실험설계로 체세포 핵이 식으로 작성된 배반 포의 inner cell mass (ICM)와 trophectoderm (TE) 세포수를 조사하였다. 실험결과 초기 46시간 동안 glycine이 첨가된 320 mOsm 처리군에서 배양된 난자의 ICM 비율이(26.0%) 280 mOsm 삼투압에 glycine을 첨가한 군(17.8%)에 비해 유의적(P<0.05)으로 증가하였다. 본 연구결과 단위 생식 및 체세포 핵이식 난자의 체외배양에서 glycine의 첨가 및 체외 배양초기 48시간 동안 320 mOsm 삼투압 처리는 배 발육과 배반포 세포수를 증가시키는 것으로 확인되었다.

최근 조직공학 기술의 발달로 재해와 질병으로 인한 손상된 조직과 장기의 대체연구들 이 진행되고 있다. 장기 대체 연구의 핵심 요소 중 하나는 재건된 조직이나 장기가 혈관 망을 형성하여 host tissue로부터 양분과 산소의 전달이다. 본 연구는 조직공학 기법을 이용하여 장기 재건에 필수적인 혈관 재건을 위해 혈관을 구성하는 주세포인 endothelial cell을 체외에서 배양하는 것이다. Endothelial cell(EC)배양을 위해서는 세포지지체인 세 포외 기질(External cellular metrics, ECM)을 필요로 하기 때문에 ECM중에 대표적인 collagen과 gelatin을 사용하여 지지체에 따른 체외배양능을 비교하였다. 실험 동물로는 돼지 대동맥을 채취하여, 대동맥 속에 collagenase type I을 주입하고, 혈관의 입·출구를 봉합한 상태로 10분 간 37℃에서 처리하였다. 관류된 용액은 10% FBS가 함유된 기본배 양액(EGM-2 media)을 사용하여 2번 수세한 후 회수된 세포를 각각의 ECM이 처리된 dish위에서 배양 하였다. EC세포인지를 확인하기 위해서 EC표지 인자인 CD31과 vWF 항체의 발현을 flow cytometry로 확인 하였고, 회수된 세포에서 두 단백질이 모두 발현 되었다. ECM에 따른 EC의 세포 형태를 비교하였을 때 형태학적 차이는 없었다. Basement Membrane Extract위에서 calcein-AM으로 염색된 EC는 ECM의 종류와 상관 없이 2-6시간 사이에 Tube Formation을 보였다. 또한 endothelial cell의 표지 마크인 CD31, Flk1, vWF의 mRNA 발현양과 IHC에 의한 단백질 발현을 조사한 결과 collagen 지지체 위에서 배양된 endothelial cells에서 발현양이 더 높았다. 결론적으로 두 가지 ECM에서 모두 성공적으로 endothelial cell의 배양이 가능하지만 collagen위에서 배양된 endothelial cell이 더 우수한 maintenance능력을 가짐을 확인 할 수 있었다.

In order to achieve successful in vitro production of embryo, it is necessary to establish intrauterine environment during in vitro culture. Thus, this study was investigated to establish embryo culture system using co-incubated collagen matrix gel (CM) with endometrial epithelial cells (EC). Endometrial epithelial cells were isolated from porcine endometrium at follicular phase, the cells seeded in insert dish for co-incubation with CM-coated culture dish. Then, culture media treated with/without 2.0 IU/ml hCG or 10 ng/ml IL-1β. After incubation for 24 h, the co-incubated insert dishes were removed from CM-coated culture dish before embryo culture. Embryos at 48 h after in vitro fertilization (IVF) were cultured on the dish for 120 h with porcine zygote medium. We determined PTGS-2 expression in the ECs, VEGF protein in co-incubated CM with EC and observed cleavage rate and blastocyst development of embryos at 168 h after IVF. In result, expression of PTGS-2 was higher at co-incubated EC with hCG and IL-1β groups than EC without hCG and IL-1β. The VEGF protein was detected at co-incubated CM with EC, EC treated with hCG and IL-1β groups higher than CM group. Also, cleavage rate was no significantly difference among all group, however, blastocyst development was significantly higher in co-incubated CM with EC treated with hCG group than un-treated groups (p<0.05). Therefore, we suggest that novel embryo culture system using co-incubated collagen matrix gel with endometrial epithelial cells treated with IL-1β is beneficial and useful for enhancing the production of porcine blastocysts in vitro.

Recent 2 decades, including in vitro maturation (IVM), assisted reproductive technologies (ARTs) achieved noteworthy development. However the efficiency of ARTs with in vitro matured oocytes is still lower than that with in vivo oocytes. To overcome those limitations, many researchers attempted to adapt co-culture system during IVM and consequently maturation efficiency has been increased. The beneficial effects of applying co-culture system is contemplated base on communication and interaction between various somatic cells and oocytes, achievement of paracrine factors, and spatial effects of extracellular matrix (ECM) from somatic cell surface. The understanding of co-culture system can provide some information to narrow the gap between in vitro and in vivo. Here we will review current studies about issues for understanding cu-culture system with various somatic cells to improve in vitro maturation microenvironment and provide bird view and strategies for further studies.

Spermatogenesis is initiated from spermatogonial stem cells (SSCs) that has an ability of self-renewal and unipotency to generate differentiating germ cells. The objective of this study is to develop the simple method for derivation of SSCs using non-sorting of both spermatogonia and feeder cells. Simply uncapsulated mouse testes were treated with enzymes followed by surgical mincing, and single cells were cultured in stempro-34TM cell culture media at 37℃. After 5 days of culture, aciniform of SSC colony was observed, and showed a strong alkaline phosphatase activity. Molecular characterization of mouse SSCs showed that most of the mouse SSC markers such as integrin α6 and β1, CD9 and Stra8. In addition, pluripotency embryonic stem cell (ESC) marker Oct4 were expressed, however Sox2 expression was lowered. Interestingly, expression of SSC markers such as Vasa, Dazl and PLZF were stronger than mouse ESC (mESC). This data suggest that generated mouse SSCs (mSSCs) in this study has at least similar biomarkers expression to mESC and mSSCs derived from other study. Immunocytochemistry using whole mSSC colony also confirmed that mSSCs generated from this study expressed SSC specific biomarkers such as c-kit, Thy1, Vasa and Dazl. In conclusion, mSSCs from 5 days old mouse testes were successfully established without sorting of spermatogonia, and this cells expressed both mESC and SSC specific biomarkers. This simple derivation method for mSSCs may facilitate the study of spermatogenesis.

MMP-2, 9의 경우 난포의 발달, 난자의 성장, 그리고 배란 시 extracellular matrix를 재 구성하는 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있으며, 혈청배지 및 무혈청배지를 이용한 체외수정란의 배아발달 과정에 따른 MMPs(2, 9)와 TIMPs(2, 3)의 발현양상의 차이가 있 을 것으로 사료된다. 따라서 본 연구는 소의 체외성숙난자와 체외수정방법에 따른 체외수정란의 발달율과 cumulus cell(CC), single oocyte cell(SOC), cumulus oocyte complex(COC) 및 blastocyst 에서 MMPs와 TIMPs의 활성 및 단백질발현양상을 zymography와 ELISA에 의하여 분석 하였으며, immunofluorescence를 이용하여 발현위치분석을 실시하였다. 체외성숙 이후 Real-time PCR을 이용하여 mRNA의 발현양상을 분석한 결과 MMP-2, 9은 CC가 SOC보 다 높은 발현을 보였으며, TIMP-2, 3의 경우 상반된 발현양상을 보이고 있었다. MMPs의 활성도 분석결과도 mRNA의 결과와 같았으며, 배양배지의 MMPs의 단백질양적분석에서 도 같은 양상을 나타내고 있었으나, TIMP-2의 경우 SOC가 높은 발현을 보였으며, TIMP-3는 CC에서 높은 발현을 나타냈다. 위의 결과를 토대로 COC의 MMPs와 TIMPs의 단백질 작용위치를 분석한 결과 MMP-2는 난자의 세포질을 중심으로 발현양상을 나타내 고 있었으며, MMP-9에 비하여 높은 발현을 확인할 수 있었다. TIMPs의 경우 난자의 세 포질보다 난구세포에서의 발현이 높게 나타났으며, TIMP-3의 발현이 높게 나타났다. 체 외배양방법에 따른 blastocyst의 발달율은 무혈청배지(ES)(61.22% 60/98)가 혈청배지(CR- 1aa)(48.28% 28/58)보다 높은 발달율을 보였다. 체외수정배양배지의 MMPs의 단백질양적 분석결과 MMP-2는 ES가 CR-1aa보다 상대적으로 높은 발현을 보였고, MMP-9은 CR- 1aa가 ES보다 높은 발현을 보였다. TIMPs의 발현양상의 경우 대체적으로 TIMP-3의 발 현이 높게 나타났으며, apoptosis의 활성도 분석에서 Casp-3의 발현이 CR-1aa배양에서 높게 나타남을 확인할 수 있었다. MMPs와 TIMPs의 단백질작용위치를 분석한 결과는 ES는 MMPs와 TIMPs의 발현이 inner cell mass를 중심으로 발현이 높게 나타났으며, trophoblast에서는 낮은 발현이 나타났다. 이와 반대로 CR-1aa의 경우 ES와 다른 위치의 발현을 나타냈으며, TIMPs의 발현은 대체적으로 낮게 발현되었다. 따라서 본 연구 결과 는 무혈청배양 방법이 수정란의 발달 시 MMPs의 활성을 높여 배아형성에 영향을 줄 수 있을 것이라 사료된다.

The objective of this study was to evaluate the effects of co-culture of bovine oocytes with cumulus cells on in vitro maturation and development following in vitro fertilization in bovine oocytes. Bovine cumulus-oocyte complexes (COCs) and denuded oocytes (DO) were co-cultured with the cumulus cells in TCM199 for 20~22 hr, and evaluated the nuclear type of oocyte. After in vitro maturation, oocytes were coincubated for in vitro fertilization with frozen-thawed spermatozoa selected by 65% percoll in DM-Heparin and DM-Caffeine for 15~18 hr. Presumptive zygotes were cultured for 48 hr in CR1aa in vitro culture medium with 10% FBS, and evaluated the cleavage rates. The results confirmed that the highest percentage of metaphase II (M-II) stage was observed in COCs (30.1±3.5%, 24.2±1.8%) as compared to DO (7.1±1.3%, 17.4±13.9%) (p<0.05). In addition, the increased cleavage rates were obtained from COCs (69.6±2.1%, 75.6±2.9%) when compared to DO (21.6±7.5%, 29.5±12.6%) (p<0.05). In conclusion, this study suggested that cumulus cells secreted positive factors during in vitro maturation of oocytes and early embryonic development after in vitro fertilization of bovine oocytes.

The purpose of this study is to establish a basic culture system enabling in vitro culture of chicken blastodermal cells and to test the feasibility of retrovirus-mediated gene transfer to the cultured cells. The blastodermal cells were isolated from freshly laid eggs of stage X and cultured with or without STO feeder layer cells. Stem cell-like morphology was maintained after multiple passages and RT-PCR analysis proved expression of several stem cell specific genes. Immunocytochemical analysis using antibodies of anti-EMA-1 and anti-SSEA-1 also showed the feature of stem cells. Infection of the cultured blastodermal cells with LNCGW retrovirus vector resulted in successful transfer of foreign genes. The results of this study may be useful in establishing stem cell-mediated transgenic chicken production.

The objective of this study was to examine the effect of eCG and various concentrations (20, 40, and 80 ) of porcine FSH on nuclear maturation and intracellular glutathione (GSH) level of oocytes, and embryonic development after parthenogenetic activation (PA) and somatic cell nuclear transfer (SCNT) in pigs. Immature pig oocytes were matured in TCM-199 supplemented with porcine follicular fluid, cysteine, pyruvate, EGF, insulin, and hormones (10 IU/ml hCG and 10 IU/ml eCG or FSH) for the first 22 h and then further cultured in hormone-tree medium for an additional 22 h. Nuclear maturation of oocytes () was not influencem foreCG and various concentrations FSH. Embryonic development to the cleavage stage () and mean number of cells in blastocyst ( cells) after PA were not altered but blastocyst formation e-treignificaddlor(p<0.05) improvem forthe supplementation eith 80 FSHr(64%) compared to 47%, io8%, iand 47% in oocytes that were treated with eCG, 20,i and 40 FSH,i numectivelo. In SCNT, fusion () of cell-cytoplast couplets and siosequent embryo cleavage () were not influencem fordifferent gonadotropins but blastocyst formation tended to increase forthe supplementation eith 80 FSHr(25% vs. ). Our nuults demonstrated that oocyte maturation and embryonic development after PA and SCNT e-frinfluencem fortype of gcem fortype of gits concentration. In this study, supplementation of maturation medium eith 80 FSHrimproved preimplantation development of PA and SCNT pig embryos, probably by increasing intracellular GSH concentration of matured oocytes.

Spermatogonial stem cells(SSCs) only are responsible for the generation of progeny and for the transmission of genetic information to the next generation in male. Other in vitro studies have cultured SSCs for proliferation, differentiation, and genetic modification in mouse and rat. Currently, information regarding in vitro culture of porcine Germline Stem Cell(GSC) such as gonocyte or SSC is limited and is in need of further studies. Therefore, in this study, we report development of a successful culture system for gonocytes of neonatal porcine testes. Testis cells were extracted from 10～14-day-old pigs. These cells were harvested using enzymatic digestion, and the harvested cells were purified with combination of percoll, laminin, and gelatin selection techniques. The most effective culture system of porcine gonocytes was established through trial experiments which made a comparison between different feeder cells, medium, serum concentrations, temperatures, and O2 tensions. Taken together, the optimal condition was established using C166 or Mouse Embryonic Fibroblast(MEF) feeder cell, Rat Serum Free Medium(RSFM), 0% serum concentration, 37℃ temperature, and O2 20% tension. Although we discovered the optimal culture condition for proliferation of porcine gonocytes, the gonocyte colonies ceased to expand after one month. These results suggest inadequate acquirement of ingredients essential for long term culture of porcine GSCs. Consequently, further study should be conducted to establish a successful long-term culture system for porcine GSCs by introducing various growth factors or nutrients.

This study was conducted to examine the effects of human follicular fluid and gonadotropin (FSH+HCG+rhEGF) on in vitro maturation, fertilization and development of human immature oocytes. Cumulus-oocyte complexes (COCs) were collected following for in vitro fertilization and embryo transfer (IVF-ET) cycles of the patients. At the time of oocytes collection, oocytes were classified into MII, MI and GV in accordance with their appearance (MII: Fully mature oocyte at metaphase II of meiosis; MI: Nearly mature oocytes at metaphase I of meiosis; GV: Immature oocytes at prophase I of meiosis). After controlled ovarian stimulation using gonadotropin(FSH) and human chorionic gonadotropin (HCG) in 70 ICSI cycles, 158 MI to MII matured oocytes were intracytoplasmic sperm injection (ICSI) h after in vitro culture and 553 MII oocytes were ICSI after denudation. The aspirated MI and GV oocytes were cultured in culture medium containing 10% (v/v) serum protein substitute (SPS), 10% (v/v) human follicular fluid (hFF) and 10% (v/v) serum protein substitute (SPS)+1 IU/ml FSH+10 IU/ml HCG+10 ng/ml recombinant human epidermal growth factor (rhEGF). The maturation rate of immature oocytes was similar among the three group. When maturation medium was supplemented with 10% SPS, 10% hFF or gonadotropins, the fertilization rate of in vitro matured oocytes was higher in 10% SPS (80.0%), but there was no statistical significance (78.2%; hFF, 76.9%; gonadotropin, p>0.05). The development rate of human embryos developed to cells were not significant difference in the medium containing SPS, hFF and gonadotropins (65.6%, 65.9% and 66.7%). The results of these study suggest that human follicular fluid and gonadotropins supplemented in the culture medium was not effected on the in vitro maturation, fertilization and development of human immature oocytes.

In previous studies, we reported that sow which was transferred OPS-freezing embryos not able to deliver a piglet (Kim et al, 2004). This study was conducted to investigate a possibility of gilt as recipients which produce piglets after transfer of OPS-freezing embryos. All transferred embryos were prepared by in vitro production (IVP) system. In vitro culture (IVC) medium used glucose-free NCSU23 supplemented with 5mM sodium pyruvate, 0.5 mM sodium lactate and 4 mg/ml bovine serum albumin for 2 days at . From day 3 of IVC, 10% fetal bovine serum albumin was added to the culture medium. In preparing of freezing embryos, embryos were treated with 7.5 cytochalasin-B for 30 min and centrifuged at for 13 min. And then, embryos were exposed sequentially to an ethylene glycol (EG) solution, aspirated into open pulled straw (OPS), and plunged or thawed into the liquid nitrogen. In embryo transfer (ET), we used two kinds of type (surgical method vs. non-surgical method). In surgical method of embryo transfer, embryo were transferred in both uterine horn of two recipient gilts by plastic straw. Non-surgical method which is like artificial insemination was performed on three gilts. Each 140 frozen embryos were transferred to two gilts and 40 fresh embryos to one gilt. Pregnancy establishment was shown one recipient at 45 days after ET. However, the one recipient was also aborted at 58 days after ET. These results suggest that gilts can be considered as a candidate of recipients for OPS-freezing embryo transfer.