During the last three decades considerable advances has been made in goat embryo production and transfer technology. The Korean native black goat is the most useful domestic ruminant in this country for biological investigation and application because it has a lot of merits such as relatively short generation period(1 vs 2 year for a cow), easy of handling, well adaptation, high fertility, convenient and inexpensive. This article covers the methods of superovulation, estrus synchronization, embryo collection and transfer techniques, pregnancy diagnosis and subsequent pregnancy and kidding rates for the production of transgenic Korean native black goats. More than one hundred goat kids have been produced as a result of our transgenic goat project via microinjection of foreign gene into pronuclei, in vitro culture, transfer of various stages of fresh and frozen-thawed microinjected embryos into oviducts or uteri of recipient does. We have got two transgenic goats carrying a transgene targeting the expression of recombinant human granulocyte colony stimulating factor(hG-CSF) to the mammary gland so far. Since collection and transfer of embryos in this species is usually accomplished by laparotomy, exteriorization of the reproductive tract for surgical embryo collection leads to the formation of post-operative adhesions. Nonsurgical or laparoscopic technique to reduce adhesions from repeated surgeries has great advantages in improving embryo production and transfer especially from valuable donors. We will discuss this later.

During the last three decades considerable advances has been made in goat embryo production and transfer technology. The Korean native black goat is the most useful domestic ruminant in this country for biological investigation and application because it has a lot of merits such as relatively short generation period (1 vs 2 year for a cow), easy of handling, well adaptation, high fertility, convenient and inexpensive. This article covers the methods of superovulation, estrus synchronization, embryo collection and transfer techniques, pregnancy diagnosis and subsequent pregnancy and kidding rates for the production of transgenic Korean native black goats. More than one hundred goat kids have been produced as a result of our transgenic goat project via microinjection of foreign gene into pronuclei, in vitro culture, transfer of various stages of fresh and frozen-thawed microinjected embryos into oviducts or uteri of recipient does. We have got two transgenic goats carrying a transgene targeting the expression of recombinant human granulocyte colony stimulating factor (hG-CSF) to the mammary gland so far. Since collection and transfer of embryos in this species is usually accomplished by laparotomy, exteriorization of the reproductive tract for surgical embryo collection leads to the formation of post-operative adhesions. Nonsurgical or laparoscopic technique to reduce adhesions from repeated surgeries has great advantages in improving embryo production and transfer especially from valuable donors. We will discuss this later.

요 약 I. INTRODUCTION II. MATERIALS AND METHODS III. RESULTS IV. DISCUSSION V. SUMMARY VI. REFERENCES

외래 유전자를 이식하여 형질전환동물을 생산하는 방법은 현재 약 3가지 정도가 실제 이용되고 있다. 현재 가장 많이 사용되고 있는 방법으로는 DNA 미세주입법인데 생쥐와 비교하여 다른 동물에서의 형질전환효율은 상당히 낮은 것으로 나타나 형질전환가축의 생산을 위해서는 많은 비용과 시설 및 노동이 필요하여 실용성에 문제를 갖고 있다. 각 가축에 적합한 DNA 미세주입 조건을 확립시키고 형질전환동물의 생산효율을 높이는 연구가 필요하다. 가축에서 형질전환기술이 실제로 응용되고 있는 분야로는 대량생산이 어려운 의약품을 형질전환가축의 젖으로 합성 분비시키게 함으로써 생리적으로 활성이 있는 의약품의 대량생산이 가능할 것으로 예상된다. Growth Hormone이나 Growth Factor들을 이용한 성장과 관련된 형질전환가축의 기술은 예상했던 것보다 큰 성과는 없었는데 이식 유전자의 과잉발현으로 인한 부작용으로 실용화될 수 없었다. 그러므로 형질전환동물의 실용화를 위해서는 효율적인 유전자 이식방법의 개발과 이식 유전자의 발현으로 인한 부작용을 최소화하면서 좋은 표현형을 얻을 수 있도록 이식유전자의 발현을 인위적으로 조절할 수 있는 regulatory system의 개발과 가축의 경제형질에 관여하는 유전자의 식별이 필요하다.

Hehage production, botanical composition and soil chemical characteristics were investigated Ween new pastures and old pastures during grazing seasons from May 1993 to October 1994, to find out the condition of pastures grazed by horses on Chdu. Dry matte

This experiment was conducted to investigate the morphological and structual characters and the dry weight of plant (DW/pl.) concerned vegetational structure of orchardgrass pastures by the times of year, from 1 year to 7 year previous, 1986 through 1980,

영양생장기(營養生長期)의 형태적(形態的)과 건물수량(乾物收量)과의 관계(關係)를 조사(調査)하여 수량(收量)에 관여(關與)되는 형태적(形態的) 형질(形質)과 품종(品種)의 특성(特性)을 비교(比較), 검토(檢討)하였다. 1. 개체중(건물중(乾物重))은 초장(草長), 엽면적(葉面積) 및 경면적(莖面積)과 유의(有意)한 정상관(正相關)을 나타내어, 개체중의 증가(增加)는 초장(草長), 엽면적(葉面積), 경면적(莖面積)의 상호작용(相互作用)이라고 할 수 있다

형질전환 동물은 질병의 모델, 유전자 기능 및 조절에 관한 연구, 또는 독성물질을 탐색하는 연구 수단 등과 같은 기초 연구 분야뿐만 아니라 인체에 유용한 단백질의약품의 생산과 간, 신장 등 특정 장기의 공급원 등과 같은 임상적인 분야에서도 활용가치가 매우 크다. 이 중 형질전환 동물을 이용한 치료용 단백질의 생산은 비교적 낮은 생산 원가와, 분리와 정제의 용이성, 그리고 효율적인 대량 생산 체계의 확립 등의 장점을 가진다. 형질전환동물을 바이오의약품 생산수단으로 사용하고자 하는 발명에는 젖, 소변 또는 혈액을 통하여 백혈구증식인자, 조혈인자, 항체 등 고가의 생물의 약품을 배출시키는 소, 돼지, 흑염소 등이 등록되어 있다. 이 방법은 기존의 세포배양 방법보다 생산비용이 훨씬 저렴하고 부가가치도 높아 새로운 의약품 생산수단으로 주목받고 있다. 그러나 현재까지 방대한 시간과 비용이 투자되었음에도 불구하고 형질전환 가축을 이용한 바이오 의약품의 경제적인 성공사례는 매우 미미하며, 그 근본 원인은 대부분 포유류들의 긴 세대 간격, 천문학적인 비용과 많은 시간, 그리고 외래 단백질이 체내에서 과잉 발현됨으로 인해 발생하는 형질전환동물의 생리적인 부작용에 있다고 요약할 수 있다. 생체반응기로서 가금이 포유동물에 비해 갖는 장점은 첫째, 성성숙기간과 세대간격이 짧으며, 둘째, 포유류에 비해 번식능력이 대단히 높기 때문에(연간 300개 이상의 계란을 생산) 형질전환된 가금의 계통성립이 용이하고, 셋째, 비교적 적은 노력과 비용으로 많은 개체를 대상으로 하는 실험이 가능하다는데 있다. 또한 각 계란의 난백에는 총 3 g 정도의 단백질 성분이 있으며 단백질의 종류는 8가지 뿐이다. 따라서 형질전환 포유동물의 젖에 비하여 형질전환 닭의 계란에 함유된 재조합 단백질을 분리 및 정제하는 것이 훨씬 용이하다. 예를 들면, 현재 난백으로부터 특정 단백질을 분리하는 비용이 g당 10달러 정도로 추산되는데, 이는 세포배양액으로부터 특정 단백질을 분리하는 비용의 1%에 불과하다. 따라서 형질전환 닭의 생산은 기초적인 연구로서도 중요할 뿐만 아니라 계란을 이용한 치료용 단백질의 대량 생산에 있어서도 그 의미가 크다. 닭은 번식생리학적으로 포유동물과 매우 달라 기존의 포유동물 형질전환 방법을 동일하게 적용할 수는 없으며, 형태적, 발생학적 차이점을 고려하여 발전된 형질전환 닭의 생산방법에는 유전자를 전달받는 표적세포와 유전자전이 방법에 따라 다양한 방법이 이용되고 있다. 형질전환 닭의 생산을 위한 표적세포로는 stage X의 배반엽세포(갓 산란된 유정란의 배를 구성하는 세포), 원시생식세포(primordial germ cell), 닭의 난관에서 채집한 1세포기의 수정란 그리고 정자 등이 있다. 표적세포에 대한 유전자 전이 방법에는 물리화학적 DNA 전이 방법과 retrovirus (lentivirus) vector system을 이용한 방법으로 크게 나눌 수 있다. 각각의 방법은 외래 유전자의 전이 효율이나 다음 세대로의 전달 여부, 그리고 기술적인 용이성에서 조금씩의 차이를 나타내는데, 이 중 다음 세대로의 유전자 전달이 잘 이루어지고 기술적인 용이성이 높은 관계로 현재 가장 널리 사용되고 있는 방법은 배반엽세포 및 원시생식세포를 표적세포로 virus vector system을 이용하여 유전자를 전이하는 방법이다. 기존의 다른 유전자 전이 체계와 비교해 볼 때, 레트로바이러스를 이용한 유전자 전이는 기술적인 용이성과 효율적인 발현, 그리고 전달된 유전자의 유전적인 안정성 등의 장점을 나타낸다. 기존의 retrovirus vector에서는 주로 LTR이나 β-actin, CMV promoter 등과 같은 constitutive promoter를 이용한 외래 유전자의 발현은 개체 전체에 걸쳐 광범위하게 이루어지므로 형질전환 동물의 생리적인 부작용을 나타내는 경우가 많았다. 이러한 문제점을 해결하기 위해서 외래 유전자의 발현으로 인한 생리적인 부작용을 최소화하면서 또한 특정 조직에 국한하여 일어날 수 있도록 조직 특이적 발현 promoter와 유전자의 발현을 인위적으로 조절할 수 있는 promoter 등을 개발하기 위한 노력이 시급한 실정이다. 예를 들면, 닭의 난관에서 특이적으로 발현하는 ovalbumin promoter와 tetracycline inducible promoter 등이 그것이다. 또한, 필요한 경우에는 동물체에 도입된 외래 유전자의 발현을 최대화하기 위하여 WPRE (woodchuck hepatitis virus posttranscriptional regulatory element)와 같은 서열도 도입되어야 할 것이다. 본 연구자들은 retrovirus vector system을 이용하여 닭의 배반엽세포에 외래유전자를 전이하는 방법으로 형질전환 닭을 생산하는 연구를 진행하고 있으며, 선행된 연구 결과에 의하면 전이된 외부 유전자가 닭의 genome 상에 삽입되어 발현되는 것을 생산된 모든 병아리에서 확인할 수 있었다. 따라서 생체반응기로서 일반 포유류가축 대신 닭을 사용하는 것이 앞에서 언급한 시간적, 경제적 장점 외에 형질전환개체의 생산 측면에서의 성공 가능성이 훨씬 높다고 단언할 수 있다. 본 연구자는 외래 유전자의 발현율을 증가시키기 위하여 retrovirus vector에 WPRE 서열을 도입하였으며, 외래 유전자의 과잉 발현에 의한 개체의 생리적인 부작용을 최소화하기 위하여 외래 유전자의 발현에 대한 개시 및 종료가 조절 가능한 tetracycline inducible expression system을 도입하여 형질전환 닭을 생산하였다. 현재까지 형질전환 닭으로부터 발현을 시도한 재조합 단백질로는 단일클론항체, FSH, EPO, G-CSF 그리고 interferon 등이 있으며, 이들 단백질이 산란된 계란의 흰자에 분비되도록 하는 기술을 개발하여 실용화하려는 시도를 하고 있다. 그러나 현재까지 개발된 형질전환 닭의 생산에 있어서 매우 만족할 만한 성공적인 사례는 거의 전무한 실정이며, 이에 생체반응기로서의 형질전환 닭의 생산에 관한 연구가 적극적으로 진행되어야 할 것으로 생각된다.