노로바이러스는 전 세계적으로 산발적인 발병 관련 비세균성 위장염의 주요 원인 물질이다. 노로바이러스 검출을 위해 역전사 실시간 PCR (RT qPCR)이 그 민감도와 특이성으로 인해 주요 수단으로 빠르게 자리 잡았다. 그러나 RT qPCR 분석을 위해서는 정확한 바이러스 RNA 추출 방법이 필수적이다. TRIzol 시약은 생물학적 물질로부터 RNA의 추출에 이용되고 따라서 노로바이러스 RNA 추출에도 널리 사용된다. 이 연구에서는 인체 노로바이러스 유전체 그룹 I (GI) 및 유전자 그룹 II (GII)와 생쥐 노로바 이러스(GV) 중에서 GII로부터의 TRIzol 을 이용한 바이러스 RNA의 추출률이 바이러스 시료 용액의 pH에 의존했다는 내용이 다루어졌다. 실시간 PCR의 Ct값으로 비교 한 RNA 추출 수율은 산성 영역보다 알칼리성 pH에서 높았다. 이 연구 결과로 부터 TRIzol을 이용하여 GII RNA 를 추출하여 노로바이러스를 정량적으로 분석할 때 pH조 건이 대단히 중요하다는 것을 알 수 있었다.

노로바이러스는 전세계적으로 모든 연령에게 급성 장염을 일으키는 주요 원인체이다. 본 연구는 국내 식품업계의 식품종사자를 대상으로 무증상 노로바이러스 감염의 유행성을 조사하였다. 2,729명의 식품종사자에서 29명 (1.06%)이 무증상 노로바이러스로 확인되었고 이 중 5명 (17.24%)은 노로바이러스 GI 양성이었고 24명(82.76%)은 노로바이러스 GII 양성이었다. 특히 유전자 염기서열 분석과 계통 분석에서 GII-4 유전자형이 가장 유행성이 높은 것으로 나타났으며 많은 수의 무증상 식품종사자는 노로바이러스 GII-4 에 감염되어있었다. 따라서 본 연구의 결과는 무증상 식품종사자가 노로바이러스 감염에 잠재적인 전파 원인일 가능성이 있음을 보여준다. 또한 이러한 결과는 노로바이러스 예방에 대한 식품업체의 교육의 필요성을 강조한다. 무증상 노로바이러스 감염에 더 많은 주 의를 기울여야 할 것이다.

Norovirus (NoV) is an etiologic agent of human and animal acute gastroenteritis and is a member of the family Caliciviridae. NoV is classified based on nucleotide sequences of the VP1 gene into at least six genogroups (GI-GVI), among which GI, GII, and GIV are known to infect humans and GII is the most prevalent genogroup. In this study, VP1, the full gene of GII human NoV, was cloned from a human fecal sample and expressed using a baculovirus expression system. Human NoV VP1-specific monoclonal antibodies (MAbs) were produced using expressed recombinant VP1. Expressed VP1 in the recombinant virus was confirmed by polymerase chain reaction (PCR), indirect fluorescence antibody (IFA) test, and Western blot analysis. Eight hybridomas secreting VP1-specific MAbs against human GII NoV were generated and characterized. All of the MAbs produced in this study reacted with human GII NoV VP1-recombinant baculoviruses but not with other non-human calicivirus recombinant baculoviruses. These MAbs reacted specifically with human NoV GII.4-2009 virus-like particles (VLPs), and some MAbs showed cross-reactivity with other GII.4 variant VLPs. Expressed human GII NoV VP1-recombinant protein and MAbs specific to this protein can be used as useful reagents for detecting and characterizing human NoV.

본 연구는 다양한 식재료가 섞여있는 식품으로부터 노로바이러스를 효과적으로 검출하기 위한 시험법 개발에 관한 것이다. 각 식품이 가진 매트릭스가 매우 다르므로 모든 식품에 공통적으로 적용할 수 있는 표준화된 검출법이 현재로서는 없다. 본 연구에서는 발효식품(농후발효유,된장), 절임식품(깻잎장아찌, 단무지)과 생식제품을 대상으로 실험을 진행하였다. PBS, beef extract, 아미노산-NaCl 용액 등을 이용하여 바이러스에 오염된 대상식품들로 부터 바이러스의 탈리율을 비교하였다. 이로부터 다양한 매트릭스가 혼합된 식품들에 적용 가능한 탈리용액을 선별하였다. 식품의약품안전처가 제안하여 현재 국내에서 굴, 야채, 과일 등을 대상으로 바이러스 농축에 널리 사용되고 있는 식중독 바이러스 검출법인 EPCP공정(탈리-PEG 침전-클로르포름 처리-PEG 침전)과 PEG 침전과정을 한번으로 줄인 수정된 ECP공정(탈리-클로르포름 처리-PEG침전)의 효능을 비교해 본 결과 ECP공정은 EPCP공정과 비슷하거나 나은 효율로 바이러스를 농축할 수 있었다. 또 바이러스 농축 후 QIAamp® Viral RNA Mini kit를 이용하여 RNA를 추출할 경우 식품에 존재하는 RT-PCR방해 물질들이 효과적으로 제거되어 추가적인 처리가 더 필요하지 않음을 알 수 있었다. 수정된 공정을 이용하여 무를 추가한 6가지 식품을 대상으로 검출한계를 조사해 본 바 10-25 g 식품으로부터 3.125-12.5 RT-PCR unit까지 검출이 가능하였다. 이는 기존에 보고된 방법들의 검출한계보다 더 우수한 것으로 장차 다양한 식품을 대상으로 효과적인 바이러스 검출이 가능할 것으로 기대된다.

본 연구에서는 FCV 현탁액에 물리, 화학적 위생처리 후 복합효소처리라는 전처리과정을 적용한 뒤 real-time RTPCR법을 이용하여 살균효능을 분석하였다. RT-PCR 이전에 37oC에서 30분 동안 PK와 RNase A를 처리함으로써 UV, 열, 염소, 에탄올, 과초산계열 제품에 의해 불활성화 된 바이러스들은 음성 결과를 나타내었고, real-time RTPCR법을 통해 살균 효능을 정량분석한 결과, 복합효소처리를 했을 경우 무처리구보다 더 높은 살균 효능을 보이는 것을 확인할 수 있었다. 이로써 Nuanualsuwan S. 등11,18,29)의 선행연구에서와 같이 PK와 RNase A로 전처리하는 단계를 통하여 물리, 화학적 위생처리에 의해 손상되지 않은 바이러스가 RT-PCR 법에 의해 증폭되는 것을 방지함으로써 Real-time PCR법 에 대한 검출 감도를 높일 수 있음을 확인하였다. 또한, FCV를 검출하기 위해 사용된 RT-PCR과 real-time RT-PCR 두 방법 중에서도 real-time RT-PCR법이 가장 신속하면서도 민감도 높은 결과로 도출되었다. 따라서, 유전자 분석 이전에 복합효소처리는 물리, 화학적 위생처리에 의해 불활성화 된 바이러스의 RNA가 transcription 또는 증폭되는 것을 방지하기 위한 수단으로 real-time RT-PCR법과 결합 됨으로써 노로바이러스를 비롯한 식중독 바이러스를 검출 하는데 효과적으로 적용될 것으로 판단된다. 또한 식품현 장에서 전기영동 과정없이 신속하게 살아있는 바이러스만을 수치적으로 정량화함으로써 식품안전에도 기여할 것으 로 사료된다.

Norovirus causes acute gastroenteritis in all age groups and its food poisoning outbreaks are rapidly increasing in Korea. Reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) is most widely used for the rapid detection of foodborne viruses due to high sensitivity. However, the false positive results of RT-PCR obtained against already inactivated viruses could be a serious drawbacks in food safety area. In this study, we investigated a method to yield true positive RT-PCR results only with alive viruses. To decompose the RNA genes from dead viruses, the enzymatic treatments composed of proteinse K and Ribonuclease A were applied to the sanitized and inactivated virus particles. Another aim of this study was to quantify the efficiencies of several major sanitizing treatments using realtime RT-PCR. Feline calicivirus (FCV) that belongs to the same Caliciviridae family with norovirus was used as a surrogate model for norovirus. The initial level of virus in control suspension was approximately 104 PFU/mL. Most of inactivated viruses treated with the enzymatic treatment for 30 min at 37oC were not detected in RT-PCR, Quantification results to verify the inactivation efficiencies of sanitizing treatments using real-time RT-PCR showed no false positive in most cases. We could successfully develope a numerical quantification process for the inactivated viruses after major sanitizing treatments using real-time RT-PCR. The results obtained in this study could provide a novel basis of rapid virus quantification in food safety area.

오염된 식품으로부터 바이러스를 효과적으로 검출하기 위해서는 식품에 부착된 바이러스를 효과적으로 elute시키는 것이 결정적으로 중요하다. 본 연구에서는 채소류에 공통적으로 적용할 수 있는 elution용액을 찾기 위해 폴리오 바이러스를 인위적으로 오염시킨 1가지 엽채류 (깻잎) 와 3가지 근채류 (당근, 양파, 무) 로부터 바이러스 회수율을 조사한 후, 최적의 바이러스 회수조건을 찾기 위해 기보고된 상추와 양배추의 회수율을 함께 분석하였다. 바이러스의 회수율은 식품의 matrix와 사용된 elution용액의 종류에 따라 차이가 컸으나 0.25M threonine / 0.3M NaCl (pH 9.5) 또는 0.25M glycine / 0.14M NaCl (pH 9.5)을 사용하였을 때 6가지 채소 중 5가지로부터 폴리오바이러스를 효과적으로 elute 할 수 있었다. 0.25M threonine / 0.3M NaCl (pH 9.5)를 노로바이러스 검출에 적용해 본 결과 근채류인 당근보다 엽채류인 깻잎으로부터 노로바이러스 GII를 더 잘 검출할 수 있었다. 이 같은 공통 elution용액을 사용할 경우 다양한 종류의 채소류에 오염된 노로바이러스를 포함한 소화기바이러스의 검출을 용이하게 해 줄 것이다.

The purpose of this study was to examine the appearance of norovirus in the water for food in food service institutions and the influence of physicochemical and microbial factors of norovirus in order to work out basic data to predict the detection of norovirus. Among 82 samples of water for food in food service institutions, norovirus appeared in 7 samples and the rate of appearance was 8.5%. As for the type of norovirus, one samples contained GI type (genotype GI-6) and six samples contained GII type (genotype GII-2, GII-4, GII-12). In the regression model of prediction of norovirus, the rate of appearance was correlated with NH₃-N, total solids and the consumption of KMnO₄, out of such variables as NH₃-N, total solids, the consumption of KMnO4, depth, chloride and total colony counts, and its contribution rate for effectiveness was 78.60%. In order to examine the influential factor of environment upon the detection of norovirus, Pearson's correlation analysis was carried out. The predictable regression formula for appearance rate of norovirus was expressed as -1.818 + 42.677 [NH₃-N] + 0.023 [total solids] + 0.762[consumption of KMnO₄] -0.009 [depth] -0.146 [chloride] + 0.007 [total colony counts] (R = 0.904, R² = 0.818,adjusted R² = 0.786, p < 0.05). The most influential factors upon the detection of norovirus were NH₃-N, total solids and the consumption of KMnO₄. In other words, when the measured values of NH₃-N, total solids and the consumption of KMnO₄ were higher, the possibility of appearance of norovirus increased.

The occurrence trends and moleculargenetic characteristics of noroviruses detected from gastroenteritis patients in Jeju from 2008 to 2010 were investigated. In addition, the norovirus contamination and its characteristics of groundwaters in Jeju were examined. The incidence caused by norovirus in viral gastroenteritis patients has increased every year and was higher in male than in female. The patients caused by norovirus occurred throughout all months. The incidences started to increase from November, were very high from December to February, started to decrease from March, and were very low from June to September. The patients caused by norovirus occurred throughout all ages, however, the infants below 5 years were the most susceptible to norovirus infection and the age group from teens to forties were the most insensitive to norovirus infection. The sequencing analysis showed that 18 genotypes (8 genogroup I (GI) and 10 genogroup II (GII)) were detected, the incidences caused by GI and GII were 11.5% and 88.5%, respectively, and predominant genotype was GII-4 (70.5%), which was the major genotype giving rise to norovirus incidences in Jeju, together with GII-3 (6.1%) and GI-4 (4.1%). Among 20 groundwaters sampled at 9 wells (4 non-drinking water wells and 5 drinking water wells), noroviruses were detected from 2 groundwaters sampled at one non-drinking water well and their genotypes were GI-5 and GI-8.