This study was designed to evaluate a repeated oral dose toxicity and immunomodulating activity of Pulsatilla koreana and Artemisiae annuae in Sprague-Dawley rats. The female rats were treated with Pulsatilla koreana and Artemisiae annuae of control group, low group (0.5 ml/kg), medium group (1 ml/kg), high group (2 ml/ kg) for distilled water, intragastrically for 4 weeks, respectively. To ensure the safety of Pulsatilla koreana and Artemisiae annuae such as the following were observed and tested. We examined the body weight, the feed intake, the clinical signs, the ophthalmological test, the hematological and the serum biochemical analysis. We also observed the histopathological changes of liver and kidney in rats. Hematological results were the increase of neutrophils, lymphocytes and monocytes in the high dose group of Pulsatilla koreana. The increase immune cells in the high dose group of Pulsatilla koreana might immunomodulating activity. No significant differences in body weight, feed intake, serum biochemical analysis and histopathological between control and fed group were found. In conclusion, Pulsatilla koreana and Artemisiae annuae is physiologically safe and improve immunomodulating activity.

할미꽃 신품종 ‘겨비’는 전라남도농업기술원에서 2001년에 자생 할미꽃(Pulsatilla koreana) 종자를 화학적 돌연변이를 유발(sodium azide 3 mM/16 hr)하고, 2004년과 2005년에 특성검정을 통해 2005년에 육성되었다. ‘겨비’의 꽃은 적자색이고 약은 진노랑, 주두는 적자색이며 화형은 겹꽃으로 꽃잎이 12매이다. 주당 화경은 6.3개, 화경장과 엽장은 각각 26.4, 14.2 cm이고, 화폭과 포폭은 각각 7.5, 11

할미꽃의 정단 분열조직배양에 의한 기내 효율적 미세번식에 미치는 식물생장조절물질의 효과를 조사하기 위해 2,4-D, NAA, kinetin, TDZ와 BA를 혼용처리한 MS배지에 정단분열조직을 배양하였다. 배지내 2,4-D와 kinetin, 2,4-D와 TDZ, NAA와 TDZ 혼용처리는 캘러스 유도에 효과적이지 못하였으나 NAA와 BA가 혼용 처리되었을 때 배발생적 또는 기관분화성 캘러스가 유도되었다. 특히 0.5mg/L NAA와 1.0mg/L BA 혼용처리된 MS 배지에서는 캘러스로부터 고빈도로(62%) 신초가 형성되어 캘러스 유도 및 신초형성에 적합하였다. 적합배지에 10% coconut water를 첨가하여 30일마다 계대배양 하므로 캘러스 증식률, 신초 분화율 및 신초 신장이 현저히 증가되었는데, 그 결과 절편체 당 평균 12.9개의 shoot bud를 분리할 수 있었다. 할미꽃 기내 유도된 식물체에서 뿌리는 쉽게 분화되지 못하였으나 9.0mg/L NAA 단용 또는 0.5mg/L NAA와 1.0mg/L BA 혼용처리된 MS배지에서 캘러스를 통해서만 분화되었다. 이들 뿌리는 동일 배지에서 캘러스유도 및 식물체 분화를 반복적으로 실시하는 시원체가 되기도 하였다.

식물생장조절제의 종류와 농도를 모색하여 할미꽃의 발근 최적 조건을 조사하여 정상적인 재분화체를 획득하고자 하였다. 지금까지의 선행연구를 토대로 최적조건에서 shoot를 유도시킨 후 발근 유도 생장조절제에 바로 옮기면 shoot가 너무 작아 재분화체가 성장하지 못하고 고사되었다. 1/2 MS에서 키운 shoot를 3.0 mg/L NAA를 첨가한 배지에서 3일간 생장시킨 후, 1/3 MS로 옮겨 치상 한 경우, 약 10일 전후에 뿌리의 유도가 관찰되었다. 이렇게 뿌리가 유도된 재분화체는 염의 농도와 설탕의 농도를 동시에 순차적으로 낮추어 순화처리되었다.

할미꽃의 뿌리에 함유되어 있는 제초활성물질의 확인과 동정을 위하여 이들을 추출 정제하고 활성성분 및 제초활성을 조사하여 다음과 같은 결과를 얻었다. 1. 각종 칼럼크로마토그래피법과 Prep. HPLC의 순차적인 적용에 의해 제초활성물질이 포함된 할미꽃 뿌리의 메타놀추출물을 정제하여 2개의 활성분획을 획득하였다. 2. 최종적으로 얻어진 활성분획들을 100ppm의 농도로 조제하여 처리한 결과, 식용피 유근의 생장 억제율은 대조구에 비해 각각 48% 및 60%로 나타났다. 3. GC-MS Spectrometry에 의해 분리된 활성분획 중의 성분들을 기존자료들과 비교하여 수종의 지방산 에스테르, 2종의 탄화수소류, squalene, evidonol 및 1종의 diazepin 관련 화합물이 동정되었다.

할미꽃을 인공수분(人工授粉)하여 수정현상(受精現象)과 개화(開花) 후(後) 난장치(卵裝置)형성이 완성된 자웅배우체(雌雄配偶體)의 부위별 크기를 조사였던 바 그 결과(結果)는 다음과 같다. 1. 개화(開花) 3~4일(日) 후(後) 개(開諦)되는 화분(花粉)의 크기는 26.5μm이며 난장치(卵裝置)는 개화(開花) 2일(日) 후(後) 완성되는데 매조세포핵(媒助細胞核), 난핵(卵核) 및 난핵(極核)은 각각 10.0, 15.0, 32.5μm이다. 2. 화분관(花粉管)은 수분(受粉) 10시간후(時間後) 주두(柱頭) 상(上)에서 발아(發芽)하기 시작하고 30시간후(時間後) 화주(花柱)의 하주(下部)를 통과하며 35 시간후(時間後)면 주공(珠孔)을 통하여 주심내로 진입(進入)한다. 3. 정핵(精核)은 수정(授粉) 40시간(時間) 후(後) 극핵(極核)에 진입(進入)하고 48시간(時間) 후(後)면 난세포(卵細胞)에 들어가 수정(受精)을 완료하는데 개체간(個體間) 차이가 있는 것 같다. 4. 수정(受精) 전후(前後)하여 난세포(卵細胞), 매조세포(媒助細胞), 난핵(極核)에 다핵(多核), 다인(多仁)이 형성되는 현상이 발견된다. 5. 원배(原胚)는 수분(授粉) 4일(日) 후(後) 형성(形成)되기 시작하며 6~8일(日) 후(後)면 큰 구형(球形)으로 된다. 6.나자식물은 수정(受精) 후(後) 유리핵(遊離核)으로 분열하다가 자엽(子葉)이 되는데 할미꽃도 이러한 원시적 현상이 있는 것 같다.

할미꽃의 재배화(裁培化)를 위한 기초실험(基礎實驗)으로 대량번식(大量繁殖) 체계(體系)의 확립(確立)과 품종개량(品種改良)에 있어 그 가능성(可能性)을 검토(檢討)하고자 엽조직(葉組織) 배양시(培養時) 적정한 배지(培地) 및 생장조절제(生葬調節制)의 종류(種類)와 농도(濃度)를 구명(究明)하고 약배양(葯培量)에 적합(適合)한 시기(時期)와 저온처리(低溫處理)에 의한 화분(花粉) 2형현상(型現象)및 캘러스 유기(誘起)에 미치는 효과와 식물체(植物體) 분화(分化)에 알맞는 배양조건(培養條件)에 관하여 조사 하였으며, 재분화(再分化)된 식물체(植物體)의 염색체수(染色體數) 및 동위효소(同位酵素) 분석(分析)을 하였다. MS 기본배지(基本培地)에서 엽조직(葉組織)으로부터 캘러스 유기(誘起) 및 생장(生長)에는 auxin 단독처리(單獨處理)보다는 zeatin과의 혼합처리(混合處理)에서 가장 양호하였다. Auxin 단독처리시(單獨處理時) IBA처리구(處理區)에서는 캘러스가 연색(緣色)을 띠는 경향(傾向)이었으나 auxin과 zeatin의 혼합첨가시(混合添加時) IBA는 오히려 연색(緣色)이 멸소(滅少)하였고, NAA와 2,4-D는 연색(緣色)이 증가하였으며 zeatin 1.0mg/l 과의 혼용(混用)에서 더욱 연색(緣色)이 증가하였다. 경엽분화(莖葉分化)는 auxin류(類)만의 단독처리(單獨處理)보다는 zeatin과의 혼합처리(混合處理) 효과가 현저하여 zeatin 1.0mg/l + NAA 1.0 mg/l에서 가장 양호(良好)하였으며 2,4-D는 경엽분화(莖葉分化)에 억제적으로 작용하였다. 근(根)의 발생(發生)은 MT배지(培地)가 MS, LS, B5배지(培地)에 비하여 양호하였고 auxin 단독처리(單獨處理)보다는 zeatin과의 혼합처리(混合處理)가 효과적이었고 zeatin 2.0 mg/ㅣ + 1.0 mg/l 에서 근(根)의 발생(發生)이 가장 양호하였다. 자연상태(自然狀態)의 S 화분(花粉)은 35%였으나 4℃에서 4일간 저온처리(低溫處理)한 경우에는 53%로 높아졌으며 약(約)으로부 터 캘러스 유기(誘起)에 가장 적합한 화분발육시기(花紛發育時期)는 1핵성(核性) 소포자기(小包子期)였다. 또한 1핵성(核性) 소포자기(小包子期)의 약(葯)을 B5배지(培地)에 NAA 0.5mg/ㅣ + xeatin 1.0 mg/l를 첨가(添加)하여 배양(培養)했을때 가장 양호한 캘러스 유기율(誘起率)을 나타내었으며 植物體分化(식물체분화)는 NAA 0.5 mg/l + zeatin 0.5 mg/l에서 가장 우수하였다. 약배양(葯培養)에서 2세포성(細胞性) 소포자(小胞子)의 균등 불균등분열의 비율은 비슷하였다. 약배양(葯培養)에 의한 캘러스를 MT 배지(培地)에 NH4NO3, KNO3의 유(有) 무(無) 및 zeatin을 혼합첨가(混合添加)하여 배양(培養)했을때 식물체(植物體) 발생(發生)에 NH4NO3가 KNO3보다 효과적이었으며 zeatin 2.0 mg/l 에서 70.5%로 가장 양호하였다. 약배양유내(葯培養由來) 식물체(植物體)의 배수성(倍數性)은 반수체(半數體)(2n=8)가 28%, 2배체(培體)(2n=16)가 47%로 나타났으며 나머지는 3배체(培體), 4배체(培體)와 혼수체(混數體)였다. 분화(分化)된 캘러스, 반수성(半數性) 및 2배체(培體) 식물체(植物體)의 엽(葉)과 엽병(葉炳)을 동위효색(同位酵索) 분석(分析) 하였던 바 캘러스, 반수성(半數性) 식물체(稙物體) 및 2배체간(倍體間)에 E.S.T, P.X, M.D.H banding pattern에서 뚜렷한 차이를 나타내었으며 2배체(培體)의 엽(藥)과 약병간(藥炳間)에는 차이가 없었다.