Amnionless (AMN) is a plasma membrane protein that binds to cubilin and megalin in various epithelia and mediates endocytosis of extracellular ligands. This function has been studied in the kidney where it plays a key role in vitamin B12 and vitamin D homeostasis. Present study aimed to elucidate developmental pattern of expression of AMN during the peri-implantation period in mouse embryos. In an effort to understand functional role of AMN in the histiotropic nutrition in blastocyst, endocytotic function of AMN for apoplipoprotein was examined in blastocyst. Eight-week-old female mice were superovulated by intraperitoneal injection of 5 IU PMSG and 5 IU hCG 48h later. To obtain embryos, females were mated with males. Mouse embryos were collected at 12, 48, 56, 65, 72 and 96 h post-hCG by flushing oviducts and uterus, and we also obtained gestation day 6.5, 7.5 and 8.5 embryos in uterus. All samples were subjected to quantitative RT-PCR, whole-mount immunofluorescence and immunohistochemistry analysis. To analyze endocytotic function of AMN, we examined uptake experiment of FICT labeled apolipoprotein A-I (ApoA-I-FITC) following functional blocking of AMN in blastocysts. AMN and cubilin mRNA was expressed in all developmental stages of mouse embryos. Megalin was the first detected at morula stage. AMN protein was expressed in trophectoderm (TE) and inner cell mass (ICM). AMN and cubilin were expressed in visceral endoderm of GD 6.5 and 7.5 embryos and visceral yolk sec of GD 8.5 embryos. In normal IgG treated embryos, ApoA-I-FITC was detected in intracellular vesicles of TE and ICM. However, in the presence of anti-AMN antibody, ApoA-I-FITC was weakly detected in apical surface of plasma membrane of TE. To date, AMN has been believed to be expressed in visceral endoderm of post implantation embryos. Our results demonstrated that AMN is the important molecular partner of cubilin and megalin in the preimplantation embryos and that AMN mediates endocytosis of apoplipoprotein, which may play a crucial role in embryonic development and normal growth via supporting histiotropic nutrition during peri-implantation period.

Amnionless-cubulin complex(cubam)과 megalin은 신장 및 소장 등에서 주로 발현되며, 세포 외부에서 내부로 물질을 이동시키는 ligand-mediated endocytosis에 관여하는 단백질이다. Ligand로 작용하는 물질은 vitamine B12, D, albunin, steroid hormone 등 다양한 물질과 결합가능한 multi-ligand receptor로 알려져 있다. Female pituitary는 estrous cycle에 따라 세포의 사멸 및 생성, 호르몬의 생성이 조절된다. 따라서 본 연구에서는 estrous cycle에 따라 세포 내로의 물질 수송의 변화 가능성을 amnionless, cubulin, megalin의 발현 패턴 변화 및 성호르몬에 의한 발현 조절을 통해 밝히고자 하였다. Estrous cycle을 virgina smear를 통해 시기 별로 구분하여 pituitary 내 amnionless, cubulin, megalin의 mRNA 발현 패턴을 real-time PCR로 분석하였으며, pituitary 내 단백질의 분포는 immunohistochemistry로 분석하였다. 또한 estrogen에 의한 protein 발현의 변화를 분석하기 위해 OVX를 시행하여 estrogen을 10일 간 투여하였으며, 비투여군에는 동일 시기 동안 seasame oil을 투여하였으며, ER α KO mouse model을 이용하여 동일 계통의 female mouse diestrus, estrus 시기의 target gene의 발현 패턴을 위와 같은 방식으로 분석하였다. Amnionless mRNA 발현은 estrus 시기 유의적으로 증가하였으며, OVX 시행 시 Sham 대비 유의적으로 감소하였으나, estrogen 투여 시 유의적으로 증가하였다. 또한 ER α KO mouse는 diestrus 시기 대비 유의적인 차이는 없었으나, estrus에 비해 유의적으로 감소하였다. 반면, cubulin 및 megalin은 estrus 시기에 유의적으로 감소하였으며, OVX 시행 시 Sham 대비 유의적으로 증가하였으나, estrogen 투여 시 유의적으로 감소하였다. Pituitary에서 amnioless의 단백질 발현 패턴은 estrus cycle에서는 estrus 시기 단백질 발현량이 증가하였으나, cubulin과 megalin은 단백질 발현의 변화를 구분할 수 없었다. 반면, OVX model의 경우 단백질 발현의 차이는 구분할 수 없었다. 뇌하수체 조직내 Amnionless 및 cubulin의 발현 분포는 OVX control군의 경우 세포질 내에서만 발현하였으나, esrogen 투여군은 이들 단백질이 세포막으로 발현되는 것을 관찰할 수 있었다. ER α KO mouse의 경우 amnionless의 발현이 감소한 것을 확인할 수 있었다. Female mouse의 pituitary에서 Amnionless-cubulin complex(cubam)과 megalin의 발현 및 단백질의 분포는 estrogen에 의해 조절된다. 이들 복합체 변동에 따른 pituitary 세포에 필요한 물질수송의 변화는 estrous cycle에 따른 pituitary 기능에 중요한 역할을 할 것으로 사료된다.