Despite the long history of mushroom use, studies examining the genetic function of mushrooms and the development of new varieties via bio-molecular methods are significantly lacking compared to those examining other organisms. However, owing to recent developments, attempts have been made to use a novel gene-editing technique involving CRISPR/Cas9 technology and genetic scissors in mushroom studies. In particular, research is actively being conducted to utilize ribonucleoprotein particles (RNPs) that can be genetically edited with high efficiency without foreign gene insertion for ease of selection. However, RNPs are too large for Cas9 protein to pass through the cell membrane of the protoplasmic reticulum. Furthermore, guide RNA is unstable and can be easily decomposed, which remarkably affects gene editing efficiency. In this study, nanoparticles were used to mitigate the shortcomings of RNP-based gene editing techniques and to obtain transformants stably. We used Lentinula edodes (shiitake mushroom) Sanjo705-13 monokaryon strain, which has been successfully used in previous genome editing experiments. To identify a suitable osmotic buffer for the isolation of protoplast, 0.6 M and 1.2 M sucrose, mannitol, sorbitol, and KCl were treated, respectively. In addition, with various nanoparticle-forming materials, experiments were conducted to confirm genome editing efficiency via the formation of nanoparticles with calcium phosphate (CaP), which can be bound to Cas9 protein without any additional amino acid modification. RNPs/NP complex was successfully formed and protected nuclease activity with nucleotide sequence specificity.

현재 양송이 품종의 개발은 1980년대에 개발된 방법에 의존하여 진행되고 있다. 유전자가위를 이용한 유전자교정 기술이 다양한 분야에서 각광받고 있고, 이 기술을 버섯 육종에도 적용하기 위하여 진행된 이 연구에서는, CRISPR/Cas9 활용에 필수적인 원형질체 분리 효율을 1.0 × 10 8 /mL까지 안정적으로 끌어올렸고, spermidine을 이용하여PEG 형질전환의 효율 또한 기존 방법에 비해 100배가량 끌어올렸음을 보고한다.

약용버섯인 영지버섯의 단핵균주 육성 및 원형질체 융합을 위한 육종소재를 개발하기 위하여 원형질체를 분리하여 neohaplont를 육성하였으며, 원형질체에 자외선을 조사하여 영양요구성 균주를 유발하였다. 영지의 2핵 균주로 부터 원형질체를 분리, 재생하여 선발된 neohaplont의 선발율은 ASI 7091이 11.9%, ASI 7094는 전혀 선발을 하지 못하였으며 균주간 평균 선발율은 5.24%였다. 영지 단핵균주의 균사체로부터 분리한 원형질체에 자외선을 조사하였을 때 300초에서는 ASI 7074는 1.9%, ASI 7091은 0.17%의 생존율을 나타내었고 ASI 7100의 경우 모두 사멸하였다. 자외선을 10초에서 300초까지 자외선을 조사하여 총 1,536 colony를 얻어 영양요구주를 선발한 결과 ASI 7091 균주는 원형질체에 100초 처리한 colony에서 Nicotinic acid, PABA 요구주와 Riboflavin 요구주를 선발하였으며, 7100 균주에서는 60초의 자외선 처리에서 특성이 확인되지 않은 2개 균주를 선발하였다.

완두엽육세포(葉肉細胞)의 원형질체분리(原形質體分離) 및 융합(融合)에 있어서 효소(酵素)의 처리시간(處理時間), 의 효과(效果), 효소(酵素)의 농도(濃度)와 엽(葉)의 위치(位置)에 따른 원형질체(原形質體)의 분리(分離)에 미치는 영향(影響)과 Mole 농도(濃度)에 따른 원심분리효과(遠心分離效果), PEG용액(溶液)의 처리시간(處理時間), 산도(酸度)에 따른 융합효과(融合效果) 그리고 dimethyl sulfoxide 첨가효과(添加效果)를 구명(究明)하기 위하여 실시(實施)한 실험(實驗)의 결과(結果)는 다음과 같다. 1. 원형질체(原形質體)의 분리(分離)에는 4시간(時間)의 산소처리(酸素處理)가 가장 양호(良好)했고 의 첨가(添加)에 따라 원형질체(原形質體)의 분리속도(分離速度)가 늦어졌으며 활성도(活性度)는 4시간(時間)까지 변동(變動)이 없었고 의해서 활성도(活性度)가 장기간(長期間) 유지(維持)되었다. 2. 산소(酸素)의 농도(濃度)는 1% 이상의 처리(處理)에서 거의 동일(同一)한 원형질체분리율(原形質體分離率)을 나타냈으며 상위(上位) 1~2엽(葉)이 가장 좋은 원형질체분리율(原形質體分離率)을 보였으며 원심분리효과(遠心分離效果)는 0.4M, 0.5M에서 양호(良好)하였다. 3. 원형질체융합(原形質體融合)은 PEG 6000용액(溶液) 75분(分) 처리(處理)에서 좋은 융합율(融合率)을 보였다. 그러나 30분(分) 이내(以內)의 처리(處理)가 활성도(活性度)에 영향(影響)을 미치지 않았으며 pH 5.8인 PEG 6000의 0.2M용액(溶液)에서 가장 높은 62.84%의 융합율(融合率)을 나타내었다. dimethyl sulfoxide에 의한 효과(效果)는 융합율(融合率)이 3~7% 감소(減少)하지만 binucleate의 유도(誘道)에 유효(有效)한 것으로 추정(推定)된다.

Solanum melongena var. fructualbo 품종(品種)을 이용(利用)해서 원형질체 유리(遊離)에 미치는 여러 가지 요인(要因)을 규명하여 원형질체를 배양(培養)하여 금후(今後) 유용(有用)한 체세포잡종식물의 획득(獲得)에 필요한 기초자료로 활용하고자 실험(實驗)하였다. CPW 무기염이 함유(含有)된 0.7M mannitol 용액(溶液)에 1시간(時間)동안 전처리(前處理)한 후(後) cellulase 1.5%, macerozyme 0.2%, mannitol 0.6M, MES 0.01M, BSA 0.2%, pH 6.3에서 4시간(時間) 배양(培養)한 것이 원형질체 수량(收量) 및 상태(狀態)가 가장 양호(良好)하였다. 수세용액내(水洗溶液內) mannitol 농도(濃度)는 0.7M에서, sucrose 농도(濃度)는 0.6M로 하여 ESSCC방법(方法)으로 회수(回收)하는 것이 건전하고 안정(安定)된 원형질체 대량획득(大量獲得)에 적합하였으며, 거의 최적조건을 이용(利用)하여 처리(處理)된 원형질체를 의 밀도(密度)로 8P-KM배지(培地)에 배양(培養)했을 때 3~5일(日)부터 세포신장(細胞伸長)을 하였고, 그 이후(以後)부터 세포분열(細胞分裂)이 이루어져 10일(日) 후(後)부터 colony 형성(形成)이 관찰되었다.

감자의 엽육조직(葉肉組織)으로부터의 원형질체(原形質體) 분리(分離)에 있어서 최적생육환경(最適生育環境), 적정효소(適正酵素) 농도(濃度), 적정효소(適正酵素) 처리시간(處理時間) 및 순수분리(純粹分離)를 위(爲)한 적정(適正) sucrose의 농도(濃度)를 밝히고 감자 및 petunia의 세포융합(細胞融合)에 있어서 PEG의 분자량(分子量), 농도(濃度) 및 처리시간(處理時間) 그리고 DMSO의 첨가(添加) 효과(效果)를 밝히기 위(爲)해 수행(遂行)되었다. 원형질체(原形質體) 분리(分離)에 있어서 생육환경(生育環境)은 고습도(高濕度), 낮은 조도(照度)에서 생육(生育)된 엽육조직(葉肉組織)이 유리(有利)하였으며 pectolyase Y-23 효소(酵素)가 기내배양(器內培養)된 엽(葉)에서 원형질체(原形質體) 분리시(分離時) 좋은 효과(效果)를 나타내었다. Cellulase의 농도(濃度)는 2%(W/V)가 좋았으며 효소처리(酵素處理) 시간(時間)은 3~4시간(時間)이 좋았고 원형질체(原形質體)의 순수분리(純粹分離)는 감자의 경우(境遇) 0.4~0.5M sucrose가 효과(效果)가 좋다. 원형질체(原形質體)의 융합(融合) 시(時) 처리시간(處理時間)은 공히 30분(分)이 적당(適當)했으며 PEG의 분자량(分子量), 농도(濃度)가 높을수록 융합율(融合率)이 높았다. 감자의 두 품종간(品種間) 융합(融合)이나 감자와 petunia의 융합(融合)에 있어서도 역시 PEG의 분자량(分子量), 농도(濃度)가 높을수록 높았다. Dimethyl sulfoxide의 첨가(添加) 효과(效果)는 DMSO를 5%에서 10%첨가(添加) 시(時), 감자와 petunia의 융합(融合)에서 2~4% 융합율(融合率)이 증가(增加)되었다.