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pp.221-229
줄기세포를 임상에 적용하기 위해서는 체외에서 증식 과정이 필수적이다. 그러나 배아줄기세포와는 달리 성체줄기세포는 체외에서 증식할 경우 일정시간이 지나면 줄기세포의 특성을 잃기 때문에 임상사용에 있어 제한점을 가지고 있다. 이러한 문제점을 극복하기 위해 줄기세포의 특성을 잃지 않게 세포를 보존하는 방법이 필요하며, 본 연구에서는 탯줄 유래 줄기세포를 동결 보존한 후 해동시켜 줄기세포의 특성을 분석하였다. 사람의 탯줄 유래 세포를 분리하여 체외에서 배양한 후 2번째 또는 3번째 계대의 세포를 25% FBS와 10% DMSO가 첨가된 냉동배양액에 넣어 196℃에서 동결보존한 후, 6개월 뒤에 해동시켜 세포의 성장 속도와 유전자 및 단백질 발현을 살펴보았다. 냉동 보존한 후 세포를 해동시킨 결과74%의 생존율을 보였으며, 이 세포를 체외에서 배양하였을 경우, 냉동보존하기 전의 세포와 유사하게 방추사 모양의 섬유아세포의 형태를 나타냈다. 또한, 성장 속도 역시 냉동보존하기 전의 세포와 똑같이 10번째 계대까지 배양되었으며, 42번분열 능력을 나타냈다. RT-PCR 결과, 냉동 전후 세포 모두에서 Oct-4, nanog, SCF, NCAM, nestin, GATA4, BMP4, HLA-1 유전자는 모두 발현하였으며, Brachyury와 HLA-DR은 발현하지 않았다. 면역세포 화학 염색 결과, 배아줄기세포 단백질로 알려진 SSEA-3, -4, Oct-4 그리고 중간엽줄기세포 단백질인 Thy-1은 모두 발현하였으며, vimentin, fibronectin, HLA-1, HCAM, ICAM 모두 발현하였다. 그러나 SSEA-4과 Thy-1, vimentin, fibronectin, HLA-1는 냉동보존한 후 배양된 탯줄유래 세포에서 발현량이 증가하는 양상을 보였으며, CD44와 CD54는 감소하는 양상을 나타냈다. 또한, 조직적합성복합체 항원인 HLA-DR은 냉동보존 전후 탯줄 유래 세포에서 모두 발현하지 않았다. 이와 같이 유전자와 단백질의 발현은 냉동보존하기 전후의 탯줄 유래 세포에서 큰 차이가 없었다. 냉동 보존된 탯줄 유래 세포는 세포의 분열능력과 유전자 및 단백질의 발현이 냉동 보존 전 세포와 유사한 것으로 나타났다. 이러한 결과는 냉동보존법이 임상적으로 세포 치료 시 적절한 세포의 수나 시간을 맞추는데 효과적인 방법이 될 수 있을 것으로 기대된다.
For the clinical application, it is needed to keep characteristics of stem cells after storage for a long time. In the present study, we examined stem cell properties of human cord-derived stem cells (HUC) after cryopreservation. Cells were isolated from human umbilical cord and cultured in vitro. At passage 2 or 3, HUC were suspended at a concentration of in cryomedium consisting of DMSO and FBS. After freezing at overnight, HUC were cryopreserved at nitrogen gas. After 6 months, HUC were thawed and cultured in vitro. Assessment for the stem cell properties was made upon the morphology, population doubling time, and expression profiles of genes and various proteins. Cryopreserved HUC showed more than 70% viability and maintained fibroblast-like morphology similar to HUC before cryopreservation. Throughout the culture, they underwent average 42.8 doublings and produced cells. RT-PCR analyses showed that cryopreserved HUC expressed Oct-4, nanog, SCF, NCAM, nestin, GATA-4, BMP4, and HLA-1 genes. They did not express Brachyury and HLA-DR genes. Immunocytochemical studies showed that cryopreserved HUC reacted with antibodies against SSEA-3, -4, Thy-1, vimentin, fibronectin, HCAM, ICAM, HLA-1 proteins. They did not react with antibody against HLA-DR protein. Theses genes and proteins expression patterns of cryopresserved HUC were similar to those of HUC before cryopreservation. These results suggest that cryopreserved HUC could retain proliferative potential and they expressed various genes and proteins similar to HUC before cryopreservation. Thus, cryopreservation might be useful for HUC for future research and clinical application.
