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정자 생존성은 정자기능평가에서 중요한 부분이며 Eosin-nigrosin 염색법, Hypo osmotic swelling test법, CFDA, SYBR-14, Hoechst-33342, Calcein AM 등의 형광염색법을 통해 평가될 수 있다. 또한 Flow ctyometer를 이용, 단시간에 형광 염색된 세포를 검사하여 생 존성뿐만 아니라 정자의 여러 기능적 특성을 평가하는 기술이 최근 이용되고 있다. 이 연 구는 Flowcytometry를 사용하여 제주흑우의 동결정액에서 정자의 생존성을 평가하는 2가 지 형광염색법 간의 비교분석을 통해 정자 생존율의 차이가 있는지 알아보고자 하였다.
국립축산과학원 난지축산연구소에서 사육중인 제주흑우 2두를 인공질법을 이용하여 채 정하였으며, 정자 최종농도가 2.0×107/ml가 되도록 Triladyl-eggyolk로 희석 후 4℃에 1시 간 30분간 평형과정을 수행하였다. 그 후 스트로 정액 충전기로 정액을 충전 후 간이 액 체질소 증기 동결법으로 동결하여 LN2에 동결보존하였다. 동결보존된 정액 스트로(n=12) 를 융해하여 PBS를 이용하여 5×105/ml 농도로 희석 후 2개로 분획하였으며, 각각 Calcein Am-PI(CAM/PI)와 6-CFDA-PI(CFDA/PI)의 이중 형광염색을 실시하고 37℃, 15분간 정치 후 Flow ctyometry로 생존율을 비교 분석하였다. 분석결과 살아있는 정자 의 비율은 29.26±1.28(CAM+/PI-), 27.50±0.76(CFDA+/PI-), 약간의 생체막의 손상이 있으나 살아있는 정자의 비율은 21.67±4.92(CAM+/PI+), 23.29±2.76(CFDA+/PI+), 생체막의 손 상으로 죽은 정자의 비율은 48.44±4.18(CAM-/PI+), 48.61±2.71(CFDA-/PI+)이었으며 각 각 형광염색법간의 유의적인 차이는 없었다(SPSS v18.0 통계프로그램 사용).
본 연구결과 Flow cytometry를 사용하여 정자의 생존율을 평가할 때 Calcein AM과 6-CFDA의 차이는 존재하지 않는 점을 알 수 있었으며, 정자의 생존성 평가에 CAM/PI 방법과 CFDA/PI 방법 중 하나를 선택하여 사용 가능하다고 판단된다.
