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pp.37-46
흰쥐로부터 뇌, 심장, 관장, 폐, 신장 및 흉선 등 12종류의 기관을 계통별로 해부하여 homogenates를 만들고 cytosol을 분획한 다음, 이것을 효소원으로 하여 inosltol phosphates 대사회로에서 핵심효소인 PLC, IP_3K 및 Ins(1, 4, 5)P_3 5-phosphatase의 활성도를 조직별로 비교 측정하였다. 흰쥐의 뇌에서 분리 정제된 53KDa의 IP_3K를 Balb/c 마우스에 면역 후 비장 세포를 얻어서 골수암세포인 myeloma cells (SP_2/Ag 0-14)에 세포융합, 스크리닝 및 클로닝과정을 거쳐서 anti IP_3K murine monoclonal antibodies를 만들었다. 이 과정에서 18개의 hybridoma clone이 얻어졌고 그 중 10개의 clone만이 nonspecific binding에 기인되는background가 낮았다. Ascitic fluid를 생산시킨 후 그 Ab를 Affi-gel 15로 정제하여 IgG의 subtype을 결정하였다. 이 항체들 중에서 IgG_1과 IgG_2b를 함께 사용하여 조직의 IP_3K에 대한 immuno 반응성을 검증한 결과 대체로 비슷한 비경쟁적 저해를 보였으며 뇌조직의 IP_3K가 예민한 반응을나타내었고, 심장조직에서는 현저히 activity가 낮았다. 흰쥐의 뇌로부터 16, 100배로 정제된IP_3K효소를 사용하여 얻어진 Km값은 1.8mM, 최대반응속도V_max 값은 5.41μ㏖/mln/㎖이었다. Western blot 결과 심장조직에서는 40KDa의 IP_3K만이 관찰되었으며, 뇌속에는 면역학적으로 서로 다른 3가지의 IP_3K(53, 51 및 40KDa)가 존재하였다. 그 중 53KDa의 단백질이 활성이 큰 주 효소이며, 1.8Kb의 IP_3K gene을 완전히 encoding하는 ^32P-labeled cDNA를 probe로 만들어 Northern blot법으로 IP_3K의 mRNA를 정량한 결과 성장단계별로 이들은 모두 transcriptional 수준으로 조절받고 있음을 밝혔다.
Brain, heart, liver, lung, kidney and thymus etc. 12 organs were removed and homogenized from Dawley-Sprague rats after suffocation. After fractionation of the tissue cytosols, enzymatic activities of the key enzymes in metabolic inositol phosphates cycle, PLC, IP_3K and Ins(l, 4, 5)P_3 5-phosphatase, were measured respectively. Hybridoma monoclones producing anti-IP_3K murine monoclonal antibodies were obtained by the fusion of SP_2/Ag 0-14 and spleen cells of mouse immunized with purified 53KDa IP_3K, screening and cloning procedures. 18 cloned hybridoma cells were obtained, background due to nonspecific binding was very low with 10 clones. These Abs were purified from ascitic fluids by using affi-gel 15, and determined subtype of Abs. When immunoreactivities for rat tissues IP_3K were exercised by adding the mixed Abs of IgG_1 and IgG_2b, they showed an overall similarity with noncompetitive inhibition. Brain tissue has high sensitivity for anti-IP_3K Ab, whereas heart tissue has very low activity. In kinetic parameters Km value was 1.58mM and V_max value was 5.41μ㏖/min/㎖, respectively. Only one form of 40 KDa IP_3K was detected in heart tissues, however rat brain contains at least three immunologically distinct IP_3K(53, 51 and 40 KDa) in western blot analysis. Of them 53 KDa protein was major enzyme in enzymatic activity. Northern blot analysis with ^32P-labeled cDNA probe which encodes 1.8Kb IP_3K gene was performed. These results suggest that IP_3K are regulated at transcriptional level during rat tissue development.
