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본 실험은 일정한 발달단계(發達段階)에 있는 생쥐배(胚)를 응집시킬때 세포응집소인 Phytohemagglutinin-P(PHA-P)를 첨가 라화배(裸化胚)의 응집율과 응집된 배(胚)를 in vitro에서 배양하였을때의 배양율 및 적당한 PHA-P의 첨가농도를 조사하여 Chimera배(胚)를 생산하는데 필요한 기초지식을 얻기 위하여 실시(實施)하였다. Albino BALB/C와 CBA계통 및 C57BL 계통의 생쥐에 pregnant mare Serum gonadotropin와 human chorionic gonadotropin를 투여하여 과배란 생쥐에 PMSG와 hCG를 투여하여 과배란을 유기, 회수된 생쥐의 4세포기, 8세포기 및 상실배기 수정란을 1.0% Protease 용액으로 투명대를 제거(除去)하고 PHA-P를 첨가한 배양액에서 미세한 초자봉(硝子棒)으로 계통(系統)이 다른 두 계통(系統)의 생쥐의 배(胚)를 응집시킨 다음 응집된 배를 , 5% , 95% Air의 배양기 조건하에서 13~50 시간 배양하면서 Chimera배(胚)의 발달상태를 조사하였다. 본(本) 실험에서 얻어진 결과를 요약하면 다음과 같다. 1. 1.0% Protease 또는 1.0% Protease 및 PHA-P가 첨가된 산성 Tyrode액에서 투명대를 제거한 라화배(裸化胚)를 배반포까지 배양했을때 유의차는 없었으나 4세포기배와 8세포기배 보다 상실기배가 더 잘 발달되었으며 또한 PHA-P를 첨가하였을때가 첨가하지 아니한 때 보다 다소 좋은 경향을 보였다. 2. PHA-P 첨가시 4세포기, 8세포기 및 상실기배의 응집율은40.0~82.0%, 첨가시에는 52.0~94.0%, 첨가시에는 48.0~96.0%로 배(胚)의 발달단계(發達段階)에 따라서는 4세포기, 8세포기가 상실배기 보다 유의적으로 높았다 (P<.05). PHA-P의 처리수준에 의한 응집율에 있어서는 5 또는 첨가구가 첨가구 보다 조금 높게 나타났으나 유의차는 없었다. 3. 응집배의 상실배까지의 배양율은 PHA-P의 각(各) 수준간 및 각(各) 세포기간에 유의차가 인정되지 않았다. 응집배의 배반포까지의 배양율은 PHA-P 수준사이에는 유의차가 없었으나 4세포기와 8세포기의 배(胚)는 상실기 배(胚)보다 유의적으로 높은 배양율을 보였다 (P<.05). 4. 응집된 배(胚)가 배반포까지 발달하는데 소요되는 평균시간은 4세포기배가 38.5~40시간, 8세포기배가 26~27시간, 상실기배가 19~20시간이었다. 5. 응집율은 34.0~94.0%의 범위로서 PHA-P를 첨가할때 응집율이 더 좋은 경향을 보였으나 유의성은 인정되지 않았다. 4세포기와 8세포기의 배(胚)가 상실기배 보다 유의적으로 높았다(P<.05). 6. 응집배의 상실배까지의 발달율은 4세포기배가 52.7~84.7%, 8세포기배가 73.8~872% 였으며 세포기 사이에는 유의차는 나타나지 않았다. 그러나 PHA-P를 첨가한 것이 발달이 더 좋았다. 7. 응집배의 배반포까지의 발달율은 4세포기의 배(胚)가 41.7~77.7%, 8세포기의 배(胚)는 78.7~83.0% 상실기배가 0~19.2%였으며 4세포기의 PHA-P 처리가 미처리(未處理) 보다 유의적으로 높았다(P<.05). PHA-P를 처리했을 때 4세포기와 8세포기가 상실기의 배(胚) 보다 더 높은 발달율을 보였다.
This study was carried out to obtain basic information necessary for aggregation and in-vitro culture of mouse embryos by treating phytohemagglutinin-p (PHA-P). The 4-, 8-cell and morula embryos were obtained from female mice of albino BALE/C, CBA and C57BL strains, those were injected 5 i.u pregenant mare serum gonadotrophin and 5 i.u human chorionic gonadotrophin to superovulation. The zona pellucidia was removed by placing the embryos in Acidic Tyrode solution containing 1.0% protease or/and 5 ug/ml PHA-P. The pairs of zona free embryos were subjected to aggregation by glassneedle in BMOC-3 containing 5 ug/ml PHA-P. The aggregation embryos were cultured in Brinster's mouse ova culture-3(BMOC-3) medium under the gas phase of 5% in air for 13 to 50 hours. The results obtained in this study are summarised as follows : 1. When 4-, 8-cell and morula embryos were zona-freed in acidic Tyrode solution containing 1.0% protease or/and 5 ug/ml PHA-P, and cultured in vitro to blastocysts, the 4- and 8-cell embryos showed slightly less development rates than the morula one did, and solution of 5 ug/ml PHA-P brought some higher development rate than negative control. 2. As 2, 5 or 10 ug/ml PHA-P was added to the solution to aggregate 4-, 8-cell or morula embryos, 2 ug/ml solution represented slightly lower aggregation rate than the higher levels solutions, and 4- and 8-cell embryos showed higher rates than morula one did (P<.05). 3. In respect to the development rates of aggregated embryos to morula no significant difference was found among PHA-P levels and between 4-and 8-cell embryos. With respect to those of aggregated embryos to blastocysts the different levels of PHA-P showed similar results, however, the 4- and 8-cell embryos represented higher rates than the morula one did (P<.05). 4. The mean time necessary for development of aggregated 4-, 8-cell and morula embryos to blastocysts were 38.5-40, 26-27 and 19-20hrs. Respectively in solution for aggregation. 5. The aggregation rates of embryos were 34-94%, when treated protease or/and PHA-P. Supplementation of 5 ug/ml PHA-P to the solution for aggregation showed a trend demonstrating higher aggregation rate compared to negative control, although no significance was found. However, 4- and 8-cell embryos represented significantly higher aggregation rates than the morula one did (P<.05). 6. The development rates of 4- and 8-cell embryos to morula were 52.7-84.7 and 73.8-87.2%, respectively, showing no significant difference between two cell stages. However, the aggregation rates of embryos treated with solution containing PHA-P were higher than negative control (P<.05). 7. The development rates of 4- and 8-cell and morula embryos to blastocysts were 41.7-77.7 78.7-83.0 and 0-19.2%, respectively. The rates of 4-cell embryos treated with PHA-P were significant higher than the negative control (P<.05). The 8-cell and morula embryos also showed more rates when treated PHA-P.
