The bitterling (Cyprinidae, Acheilongnathinae) is a temperate freshwater fish with a unique spawning symbiosis with host mussels. Female bitterlings use their extended ovipositors to lay eggs on the gills of mussels through the mussel's exhalant siphon. In the present study, in April of 2020, we investigated spawning frequencies and patterns of three bitterling fish species in host mussel species in the Nakdong River basin (Hoecheon). During field surveys, a total of four bitterling and three mussel species were found. We observed bitterling's spawning eggs/larvae in the three mussel species: Anodonta arcaeformis (proportion spawned: 45.5%), Corbicula fluminea (12.1%), and Nodularia douglasiae (45.2%). The number of bitterlings’ eggs/larvae per mussel ranged from 1 to 58. Using our developed genetic markers, we identified the eggs/ larvae of each bitterling species in each mussel species (except for A. macropterus): A. arcaeformis (spawned by Acheilognathus yamatsutae), C. fluminea (A. yamatsutae and Tanakia latimarginata), and N. douglasiae (A. yamatsutae, Rhodeus uyekii, and T. latimarginata). Approximately 57.6% of N. douglasiae mussel individuals had eggs/ larvae of more than one bitterling species, suggesting that interspecific competition for occupying spawning grounds is intense. This is the first report on bitterling’s spawning events in the Asian clam C. fluminea from Korea; however, it should be ascertained whether bitterling’s embryo undergoes successful development inside the small mussel and leaves as a free-swimming juvenile. In addition, the importance of its conservation as a new host mussel species for bitterling fishes needs to be studied further.

본 연구는 2015-2018년 5월 기간 동안 납자루아과 어류의 서식 집단 중 강원도 홍천 내촌천(HN), 덕치천(HD), 정선 골지천(JG) 및 조양강(JJ)을 대상으로 기 개발된 제한절편 길이 다형성(restriction fragment length polymorphism; RFLP) 분자마커를 이용하여 숙주조개 속 난 및 치어에 대한 정확한 종 동정을 수행 후 납자루아과 어류의 숙주조개 크기에 대한 산란양상을 파악하고자 하였다. 연구대상 지역 내 납자루아과 어류는 내촌천과 골지천에서 1종(묵납자루; Acheilognathus signifer), 덕치천에서 3종(각시붕어; Rhodeus uyekii, 묵납자루; A. signifer, 줄납자루; Acheilognathus yamatsutae), 조양강에서 2종(묵납자루, 줄납자루)으로 확인되었고, 네 지역에서 모두 동서하고 있는 숙주조개인 작은 말조개(Unio douglasiae sinuolatus) 982개체를 채집하였다. RFLP 분자마커를 이용하여 납자루아과 어류의 난 및 치어가 확인된 작은말조개(N=163; 16.6%)에서 총 646개체의 납자루아과 어류의 난 및 치어(묵납자루 454, 줄납자루 43, 각시붕어 149개체)를 확인하였다. 각 지역 숙주조개 크기에 따른 산란선호도를 조사하기 위해 난 및 치어가 확인된 숙주조개(mussels with [presence] eggs/fry)와 확인되지 않은 숙주조개(mussels without [absence] eggs/fry)의 각장 (shell length), 각고(shell height) 및 각폭(shell width)의 평균 크기를 비교하였다. 그 결과 3종의 납자루아과 어류가 동서하는 덕치천의 경우 난 및 치어가 확인된 숙주조개가 확인되지 않은 숙주조개보다 각장(1.98mm), 각고(0.85mm), 각폭(0.73mm)의 크기가 통계적으로 유의하게 크게 나타났으며(Mann-Whitney U tests, P=0.002, P=0.012, P=0.009), 다른 세 개의 지역에서도 난 및 치어가 확인된 조개의 각장, 각고, 각폭의 크기가 큰 결과를 보였으나, 통계적으로 유의하지는 않았다. 추가적으로 종 간 숙주조개 당 평균산란 난 및 치어의 수를 분석한 결과 각시붕어 9.31±5.94개, 묵납자루 2.86±2.45개, 줄납자루 2.50±1.32개로 각시붕어는 묵납자루와 줄납자루보다 숙주조개 당 평균 6.45~6.81개 더 많이 산란하였고, 통계적으로 유의한 결과를 나타내었다(Kruskal-Wallis test, P<0.001). 이 결과는 본 연구 대상 납자루아과 어류 3종에서 크기가 큰 작은말조개를 산란을 위한 숙주로서 선호함을 의미하고, 조개 크기에 대한 선호도 차이가 동서하는 납자루아과 종의 수가 많을수록 크게 나타났다. 또한, 묵납자루와 줄납자루의 경우 많은 숙주조개에 적은 양의 난을 추가적으로 고르게 산란하는 반면에 각시붕어는 비교적 적은 수의 숙주조개에 많은 양의 난을 산란하는 번식전략을 나타내었다. 2종 이상의 납자루아과 어류가 서식하는 덕치천(HD)과 조양강(JJ)에서 묵납자루와 줄납자루 2종이 동일한 조개에 산란하는 것이 관찰되었다(N=4). 이는 납자루아과 어류가 2종 이상 동서할 때, 동일한 자원인 작은말조개를 자신의 산란숙주로 이용하기 위한 종간경쟁(interspecific competition)이 일어나고 있는 것으로 판단된다. 본 연구에서는 기존 연구된 생태학적 연구에 유전학적인 방법을 추가하여 각 집단 간, 종 간 숙주조개 크기에 대한 산란양상을 보다 정확히 규명하여 숙주조개를 이용하는 납자루아과 어류의 생태적 적응양상을 명확히 파악하고 더 나아가 숙주조개와 납자루아과 어류의 공생(mutualism) 혹은 숙주-기생의 상호관계(host-parasite relationship)를 규명 하는데 기여할 수 있을 것으로 기대한다.

본 연구는 PCR 기반 RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism; 제한절편 길이 다형성) 분자기법을 활용하여 난 및 치어 대상 납자루아과 어류 3종의 동정을 좀 더 빠르고 정확하게 파악하고 납자루아과 어류의 종별 산란양상 및 번식생태 이해에 대한 기여가 목적이다. 본 연구를 위해 기존 선행된 문헌자료를 확인하고 납자루아과 어류가 2종 이상 동서하고 있는 지역을 확인하여 현지조사를 수행하였다. 현지조사 결과 확인된 납자루아과 어류는 묵납자루 (Acheilognathus signifer), 줄납자루 (A. yamatsutae) 및 각시붕어 (Rhodeus uyekii)로 총 3종이 확인되었으며, 확인된 납자루아과 어류와 동서하고 있는 숙주조개 (작은말조개; Unio douglasiae sinuolatus)를 채집하여 숙주조개 속 납자루아과 어류의 난 및 치어를 확보하였다. 현지조사 결과 확인된 납자루아과 어류 3종을 대상으로 미토콘드리아 DNA COI과 cyt b 유전자 염기서열을 비교하여 각각 종별로 특이성을 지닌 부위 (단일염기변이; Single Nucleotide Variation: SNV)에 맞는 제한효소를 선정하였고, 숙주조개 속 난 및 치어를 대상으로 genomic DNA를 추출하여 PCR-RFLP 실험을 수행한 결과 현지조사 시 확인된 납자루아과 어류 3종의 독특한 제한절편 길이 양상을 전기영동을 통하여 확인하였다. 본 연구를 통해 묵납자루, 줄납자루 및 각시붕어의 종을 판별할 수 있는 RFLP 마커를 개발하였으며, 숙주조개 난 및 치어를 대상으로 정확한 종의 동정을 보다 빠르고 효과적으로 수행하여 각각 납자루아과 종별 산란양상을 보다 정확히 규명하고 향후 이들 자연개체군의 효과적인 유지, 관리 및 보전 방법 개발에 유용하게 활용될 수 있을 것으로 판단된다.