폴리드나바이러스(polydnavirus: PDV)는 일부 내부기생봉에 공생하는 이중나선형 DNA 바이러스 분류군이다. Cotesia plutellae bracovirus (CpBV)는 프루텔고치벌(C. plutellae)에 공생하는 일종의 PDV이다. 프루텔고치벌은 어린 배추좀나방(Plutella xylostella) 유충에 기 생한다. 기생 초기에 발현하는 CpBV-ELP1 유전자는 혈구세포에 세포독성을 발휘하면서 기주의 세포성 면역을 억제하여 기생에 중요한 역할을 담당하고 있다. 본 연구는 이 유전자를 담배 식물에서 발현하여 해충에 대한 경구독성을 분석하는 데 목적을 두었다. 재조합 CpBV-ELP1 단백질 이 배큘로바이러스 발현시스템을 통해 합성되어 세포배양액에 분비되었다. 수거된 세포배양액은 일련의 단백질 분리과정(ammonium sulfate 단백질 분획, size exclusion 크로마토그래피, 이온교환 크로마토그래피)을 통해 CpBV-ELP1 단백질을 분리하는 데 이용되었다. 분리된 rCpBV-ELP1 단백질은 파밤나방(Spodoptera exigua) 혈구에 대한 뚜렷한 세포독성을 보였다. CpBV-ELP1은 파밤나방 5령충에 대해서 혈강 주입하여 살충력을 나타냈고, 엽침지법을 이용하여 경구독성을 갖고 있는 것을 확인하였다. CpBV-ELP1 유전자를 CaMV 35S 유전자 프로모터 와 opaline synthase 유전자 전사종결신호를 갖는 pBI121 벡터에 클로닝하여 Agrobacterium tumefaciens LBA4404 세균에 형질전환을 유도하였 다. 형질전환된 세균은 담배(Nicotiana tabacum Xanthi)잎에 감염하여 캘러스를 유도하게 하였고 이후 차세대(T1)를 확보하였다. T1 세대 담배 는 파밤나방에 대한 해충저항성을 갖고 있음을 확인하였다. 이러한 결과는 CpBV-ELP1 유전자가 형질전환작물을 통해 해충방제에 응용될 수 있 다는 것을 제시하고 있다.

폴리드나바이러스(Polydnavirus)는 기생봉에 공생하는 곤충 DNA 바이러스로써 곤충의 면역억제와 발육지연 기능을 나타내는 유전자들을 포함하고 있다. 기존 폴리드나바이러스의 부분적인 유전체 정보 뿐만 아니라 최근 이 바이러스의 브라코바이러스(Bracovirus)에 속한 Cotesia vestalis bracovirus(CvBV)의 유전체가 완전 해독되고 기생봉에 대한 다양한 transcriptome 분석이 이루어짐으로써 유전체 정보들이 급격히 축적되어 곤충의 면역교란과 발육지연에 관련된 유전자의 기능 분석 연구가 가속화 되고 있다. 유전자 기능분석은 재조합단백질, 항체, RNAi 기법과 같은 단백질 및 유전자특성을 이용하여 충체에 직접 작용시켜 생리작용을 분석하거나 잠재적 기능을 지닌 유전자를 형질전환식물에 발현시켜 생물적 기능을 검정하는 방법으로 대별할 수 있다. 곤충의 면역과 발육억제에 관련된 곤충 바이러스 유전자군의 단백질 발현이나 곤충의 특정 유전자의 발현을 억제하는 double strand RNA를 발현 시키는 형질전환식물을 이용한 기능검정은 궁극적으로 해충저항성 작물개발에 필요한 핵심적인 자료를 제공한다. 지난 수 년 동안 폴리드나바이러스 유전자 정보를 이용한 기능분석 연구의 결과물들은 해충저항성 작물개발에 있어 곤충바이러스 유전체 정보가 유전자 자원으로써 활용될 가능성이 높음을 제시하고 있다. 이와같은 폴리드나바이러스 유전체 정보의 활용에 대한 최근 동향과 형질전환식물체의 제작에 대한 기본적인 접근방향을 제시하고자 한다.

폴리드나바이러스의 일종인 CpBV (Cotesia plutellae bracovirus) 바이러스 게놈에 포함된 시스타틴(CpBV-CST1) 유전자의 과발현이 곤 충의 면역 및 발육을 교란한다. 이 연구는 바이러스 유래 시스타틴의 생물적 기능의 심화 연구와 해충저항성 작물 개발을 위해 담배형질전환체를 구축하는 데 목적을 두었다. 이를 위해 형질전환체를 대상으로 목표유전자의 발현분석과 곤충에 대한 발육억제에 대한 생물검정을 수행했다. 시 스타틴 유전자를 pBI121 운반체에 재조합한 pBI121-CST를 제작하고, 이를 아그로박테리움(Agrobacterium tumefasciens) 세균 매개에 의한 담 배 형질전환 및 재분화를 유도하여 약 92%의 높은 신초 재분화율을 나타냈다. 이들 재분화된 개체 가운데 담배 genomic DNA에 시스타틴 유전 자가 삽입된 형질전환 추정 개체를 PCR 분석법으로 선발하였다. 다시 quantitative real-time PCR (qRT-PCR) 분석을 통해 이들 목표유전자 의 발현을 분석하였다. qRT-PCR 결과는 형질전환 추정 개체가 비형질전환체에 비해 유전자 발현이 약 17 배 높게 나타나 형질전환계통에서 목 표유전자가 안정적으로 발현되고 있음을 확인했다. 선발된 형질전환담배를 대상으로 갓 부화한 담배나방(Helicoverpa assulta) 1령 유충에 대한 살충효과를 확인하였다. 살충력에 있어서 형질전환계통간의 차이가 있었다. 특히 T9와 T12계통은 섭식 후 7 일차 조사에서 95% 이상의 살충효 과를 보였다. 이상의 결과들은 CpBV-CST1이 해충저항성 작물 개발에 필요한 유용 유전자 자원으로서 활용될 수 있음을 제시하고 있다.

폴리드나바이러스의 일종인 CpBV (Cotesia plutellae bracovirus) 바이러스 게 놈에 포함된 시스타틴 유전자의 과발현이 배추좀나방 유충의 면역 및 발육을 교란 한다. 이 연구는 바이러스 유래 시스타틴의 생물적 기능을 형질전환식물을 통해 검 정하고, 해충저항성 작물 개발을 위한 기반 연구로서 담배형질전환체를 구축하는 데 목적을 두었다. 아울러 목표유전자의 발현분석과 곤충에 대한 발육억제에 대한 분자생물학적 분석과 생물검정을 수행했다. 시스타틴(cystatin: CST) 유전자를 pBI121 운반체에 재조합한 pBI121-CST를 제작하고, 이를 agrobacterium 매개에 의한 담배 형질전환 및 재분화를 유도하여 약 92%의 높은 신초 재분화율을 나타냈 다. 목표유전자의 삽입여부와 발현분석으로 담배 genomic DNA에 시스타틴 유전 자가 삽입된 형질전환 추정 개체를 선발하였다. Quantitative real-time PCR 분석을 통해 형질전환 추정 개체가 비형질전환체에 비해 유전자 발현이 약 18배 높게 나타 나 형질전환계통에서 목표유전자가 안정적으로 발현되고 있음을 확인했다. 형질 전환 추정 개체의 생물적 기능 분석으로 담배나방 유충 섭식조사를 수행하여 유의 한 살충효과를 확인하였다. 섭식 후 7일차 조사에서 T9와 T12계통은 95% 이상의 살충효과를 보였으며, 3일차에서도 40% 이상의 살충효과를 나타내었고 계통간의 차이가 있었다. 이상의 결과들은 시스타틴이 곤충 발육을 억제하는 생물적 활성을 나타내며, 해충저항성 작물 개발에 필요한 유용 유전자 자원으로서 활용될 수 있는 기능이 있음을 제시하고 있다.

프루텔고치벌(Cotesia plutellae)은 내부기생봉으로 배추좀나방(Plutella xylostella) 의 어린 유충을 기생시켜 치사에 이르게 한다. 이 고치벌에 공생하는 폴리드나바이 러스인 C. plutellae bracovirus (CpBV)는 156개의 유전자를 갖고 피기생 기주의 생리를 교란하게 된다. 본 연구는 이 바이러스가 갖는 유전자들 가운데 cystatin에 대해서 유전자 염기서열 분석 및 발현 패턴과 생리적 기능을 탐구했다. CpBV는 3 개의 cystatin을 갖으며, 이를 각각 CpBV-CST1, CpBV-CST2, CpBV-CST3로 명 명하였다. 이들 ORF의 염기서열을 바탕으로 추정된 아미노산 서열은 다른 폴리드 나바이러스 cystatin과 높은 상동성을 보였다. 이들 유전자들의 발현을 분석한 결과 CpBV-CST1과 CpBV-CST3는 기생된 기주에서 발현되나, CpBV-CST2는 발현 되지 않아 pseudogene으로 판명되었다. CpBV-CST3는 피기생체에 특이적인 반 면, CpBV-CST1은 비기생 기주에서도 발현되었으며, 이 배추좀나방 유래 cystatin PCR 결과물(Px-CST1)을 염기서열 분석한 결과 CpBV-CST1의 ORF 서열과 100% 일치하였다. Px-CST1은 배추좀나방 전체 발육 기간 중에 발현되나, 조직적 으로 보면, 중장과 표피에서 주로 발현하였다. 반면에 피기생 기주에서 이 유전자 가 혈구 조직에서도 추가로 발현되는 현상을 나타났다. 이는 CpBV-CST1이 혈구 에 특이적으로 발현을 보이는 것으로 해석되었다. CpBV-CST3는 기생 전체 기간 발현되었고, 지방체, 혈구, 소화관 및 표피에서 발현되었다. CpBV-CST1을 진핵생 명체 발현벡터에 클로닝하여 transient expression을 유도한 결과 처리된 유충의 면 역이 크게 둔화되고, 발육이 지연되는 생리적 교란을 유발하였다. 본 연구 결과는 바이러스 유래 cystatin 유전자가 배추좀나방의 곤충생리인자로 작용한다는 것을 제시하고 있다.

내부기생봉의 일종인 프루텔고치별(Cotesia plutellae)이 배추좀나방(Plutellae xylostella)을 대상으로 생물적 방제제로 이용되고 있다. 이 기생봉은 생식기관에 폴리드나바이러스를 공생시키고, 이 바이러스의 존재는 기생봉의 성공적 기생에 필수적이다. 본 연구는 암컷 프루텔고치벌 성장에 따라 플리드나바이러스의 복제시기를 결정하였으며, 또한 교미나 기주 요인에 따른 암컷의 생식 능력을 분석하였다. 기생봉은 발육조건에서 용화 2일째 겹눈과 날개와 같은 성충조직을 발달시키기 시작했으며, 5일째에는 촉각을 포함한 모든 성충조직이 발달되어 우화 직전 단계의 모습을 보였다. 프루텔고치벌 폴리드나바이러스에 대한 다클론성항체에 의한 면역블로팅 분석은 용화 4일째에서 바이러스 복제를 확인할 수 있었다. 바이러스 입자들은 용화 5일째 산란관 내부에서 투과전자현미경으로 관찰되었다. 우화후 난소소관의 길이는 변하지 않았지만, 독샘과 난소받침의 크기는 증가했다. 교미한 암컷은 에서 약 8일관 생존하였으며, 초기 4일동안 집중된( 이상) 산란을 보였다. 미교미 암컷은 교미한 암컷에 비해 낮은 산란을 보였으며, 이 미수정난은 모두 수컷으로 발육하였다. 프루텔고치벌은 배추좀나방과 미국흰불나방(Hyphantria cunea)모두를 기생시킬 수 있었다. 그러나 배추좀나방에서 더 빠르고, 높은 기생율을 보였다.