선행연구에서 화장품 소재로서 보습력과 방부력을 가지고 있는 1, 2-hexanediol (HD)의 transgalactosylation 반응을 통하여 galactose한 분자가 HD에 결합한 1, 2-hexanediol galactoside (HD-gal)의 합성을 확인하였다. 본 연구에서 재조합 β-galactosidase (β-gal)가 발현된 Escherichia coli (E. coli) 세포를 이용하여 약 94%의 수율로 HD-gal가 합성되는 것을 관찰하였고, HD-gal을 합 성한 후, 보다 효과적인 HD-gal의 정제 방법에 대하여서도 연구하였다. 먼저 고농도의 lactose (300 g/l) 존재 하에서 β-gal을 함유한 E. coli 세포를 이용하여, 48 시간 동안 75 mM의 HD로 부터 HD-gal이 합성되는 것을 TLC 분석으로 확인하였고, 반응액에서 E. coli β-gal의 존재를 Western blotting으로 확인할 수 있었다. HD-gal을 효과적으로 순수 정제하기 위하여, 용매를 사용하여 transgalactosylation 반응이 끝난 후 잔여 HD를 우선 제거하고, 이어서 silica gel chromatography를 수 행하는 방법을 실시하였다. 물에 녹지 않는 용매로는 methylene chloride와 ethyl acetate를 선택하여 비 교 실험하였는데, ethyl acetate를 사용하여 4회 물층을 분획하여, 잔여 HD를 효과적으로 제거할 수 있 었다. 그 후, 이어서 silica gel chromatography 수행하여, 순수한 HD-gal을 효과적으로 정제하였다. 반 응에 첨가된 75 mM의 HD를 기준으로 최종 정제된 HD-gal의 생산 수율은 mole 기준으로는 약 8.9±0.6% (n=3), weight 기준으로 약 21.1±1.4% (n=3) 정도였다. 앞으로 이러한 정제 방법을 이용하 여 얻은 HD-gal의 항균력 변화를 HD와 비교하여 평가할 예정이고, 피부세포에 대한 독성 변화를 역시 HD와 비교하여 분석할 예정이다.

화장품용 방부제로 사용하고 있는 1, 2-hexanediol (HD)에 높은 농도의 lactose (300 g/l)를 넣고, 재조합 대장균 β-galactosidase (β-gal)를 이용하여 galactose 한 분자를 결합시키는 transgalactosylation 반응을 시켜서, 1, 2-hexanediol galactoside (HD-gal)을 합성하였다. 그리고, 합성 된 HD-gal 분자를 확인하기 위하여, HD-gal에 대한 NMR (1H- and 13C-) 스펙트럼 분석과 mass 스 펙트럼 분석을 실시하였다. HD-gal의 1H NMR 스펙트럼에서 HD에 갈락토실화가 되었음을 보여주는 다양한 피크를 확인하였다. 1H NMR 스펙트럼의 다운필드인 δH 4.44 ppm과 δH 3.96~3.58 ppm에서 나타나는 다양한 피크들은 HD에 갈락토실화가 되었다는 것을 잘 암시하고 있으며, 또한 1H NMR 스 펙트럼의 업필드에서 나타나는 δH 1.60~1.35 ppm과 0.92 ppm의 피크는 HD의 CH2와 CH3 작용기로 부터 나타나는 피크로써 HD가 본 물질에 존재한다는 것을 나타내고 있다. 13C NMR 스펙트럼에서는 HD-gal의 알파-아노머와 베타-아노머의 구조에서 기인하는 총 21의 카본피크가 나타났고, 각 아노머 마다 12개의 카본이 존재하는데 이중 δC 68.6, 60.9 and 13.2 ppm에 보이는 3개의 카본은 겹쳐서 나 타나 총 24개의 피크 중 21개가 나타났다. 또한, 질량스펙트럼 분석에서는 protonated HD-gal인 281.1601 (m/z)의 peak를 확인할 수 있었다. 이를 종합하면, NMR (1H- and 13C-) 스펙트럼 분석 결 과와 질량분석 결과들은 우리가 기대했던 HD-gal의 구조와 매우 잘 일치하고 있다는 것을 알 수 있었 다. 앞으로 추가적으로, 세균에 대한 minimum inhibitory concentrations (MICs) 조사와 human skin cell에 대한 독성연구를 추가적으로 진행할 예정이며, 이러한 결과를 근거로 항균력을 유지하면서 피부세 포에 대한 독성이 감소된 화장품용 방부제의 연구/개발이 계속되기를 기대하고 있다.

화장품에 방부제(살균/보존제)로 사용되는 1, 2-hexanediol (HD)로 인한 부작용을 극복하기 위하여, Escherichia coli (E. coli)의 β-galactosidase (β-gal)를 이용하여 transgalactosylation 반응으로 1, 2-hexanediol galactoside (HD-Gal)를 합성하였다. 본 연구에서는 합성된 HD-Gal의 인간 피부세포에 대한 독성이 어느 정도인지를 HD와 비교하여 관찰하였다. HD-Gal과 HD의 세포독성은 인간 피부각질형성세포 (HaCaT cell line)에 HD와 HD-Gal을 처리한 후, cell proliferation assay를 이용하여 비교 분석하였다. 또한 이때, 위상차 현미경으로 HD-Gal과 HD로 처리한 세포의 상태를 비교 관찰하였다. 그 결과, HD-Gal은 42.2 mM에서 211 mM의 농도 범위에서 세포독성이 관찰되지 않았으며, 현미경 관찰에서도 큰 변화를 관찰할 수 없었다. 그러나, HD의 경우에는 저농도에서(42.2 mM and 84.4 mM)는 세포독성이 관찰되지 않았으나, 고농도 (168.8 and 211 mM)에서 매우 높은 세포독성을 나타내었고, 현미경 관찰에서는 고농도에서는 물론이고, 세포 독성이 관찰되지 않은 HD의 저농도에서도 세포모양과 세포 수에서의 변화가 관찰되었다. 앞으로 세포독성이 감소된 HD-Gal이 HD의 대체제로서 안전, 건강 및 웰빙 개념의 새로운 용도로 개발될 수 있을 것으로 생각된다.

재조합 대장균의 β-galactosidase (β-gal)을 이용하여 transgalactosylation 반응으로 1, 2-hexanediol galactoside (HD-gal) 합성을 수행하였다. 먼저, 합성 반응을 수행할 때의, β-gal의 양, 1, 2-hexanediol (HD)의 양, 반응 pH, 반응 온도 등 반응조건을 최적화하였다. β-Gal은 4.8 U/mL, HD는 75 mM, pH는 7.0, 온도는 37 ℃의 조건이 최적 합성 조건이었으며, 이때, 약 96%의 HD가 HD-gal로 conversion 되었 다. 그리고, 돼지 epidermis를 이용하여 HD와 HD-gal의 water holding capacity (WHC)를 비교 측정하여 보았는데, 이때, epidermis 표면에 HD와 HD-gal을 84.4, 126.6, 168.8, 211.0 mM을 처리하였으며, 84.4, 126.6, 168.8 mM의 HD와 HD-gal을 처리하였을 경우 HD-gal이 HD보다 더 큰 WHC 값을 보여 주었고, 168.8 mM의 경우에는 HD-gal이 HD와 비교하여 최대 약 20% 정도의 더 큰 WHC 값을 보여 주었다. 그러나, HD-gal의 MIC (minimal inhibitory concentration) 값을 측정해 본 결과, Enterococcus faecalis의 경우에는 HD의 MIC와 같았으나, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus의 경우에는 약 3배에서 10배까지 HD-gal의 MIC 값이 HD에 비하여 증가되는 현상이 관찰되었다. 결론적으로, HD의 transgalactosylation 반응으로 인하여 합성된 HD-gal의 보습력은 HD에 비하여 증가되고, HD-gal의 항균력은 HD 와 비교하여 감소하는 현상을 관찰하였다.