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목적: 기존의 전안부에 떨어뜨리는 topical agents 방식은 후안부의 망막 신생혈관 질환에 대해 효과적인 치료제 전달 방식이 될 수 없다. 우리는 Alginate를 사용하여 생분해성을 가지고, 보다 적은 횟수의 주입술과 철 나노입자로인해 선택적으로 약물을 방출 할 수 있어, 직접적이고 효과적인 망막변성 질환을 치료할 수 있는 Ferrogel 이식체(Fe3O4-RGD – Alginate)를 고안하였다. Alginate는 그 자체의 특성 때문에 gel 형성시 자연적으로 nano size기공이 형성된다. 우리는 손상이 적고 형태를 유지하며 건조 할 수 있는 CO2 초임계 건조 장치(Critical Point Dryer)를 사용하여 기존의 얼음의 결정을 이용한 macro-porous ferrogel의 기공사이즈를 nano scale로 조절하였다. 이에 따라 Ferrogel의 세포부착성과 약물 로딩/방출에 관련된 기공 크기의 조절, 유사 환경을 조성하기 위한 인공 유리체 합성과 dish를 제작하여 약물방출에 관한 in vitro 실험 모델을 연구하였다.
방법: Sodium alginate와 세포부착 RGD- peptide를 합성하기 위해, Alginate 0.1 g에 MES buffer 5 ml,EDC 5 mg, sulfo-NHS 2.8 mg, RGD-peptide 100μg를 균질하게 섞고, 동결건조 시켰다. Ferrogel을 제작하기 위해 MES buffer(pH 6)에 RGD-peptide가 결합된 Sodium Alginate(SA-R) 1wt%와 가교 결합제인 Adipic acid dihydrazide 5mM, Fe3o4 nano –particle 13wt%, HOBt hydrate, EDC를 균질하게 섞어주었다. 그 후, 즉시 틀에 넣고 2시간 동안 굳혀준다. 굳혀진 Gel의 잔류시약을 제거하기 위해 대용량의 삼차증류수에 2일 동안 넣어 두었다. 그런 다음, macro–porous의 기공을 만들기 위해 –20℃에 얼린 후, 동결건조 시켰고, nano- porous의 기공을 만들기 위해, 잔류시약 제거 후, 초임계 건조 장치를 이용해 말렸다. 인공유리체를 만들기 위해 PBS, Hyaluronic acid(HA 1wt%), triethylamin, glycidyl methacrylate, tetrabutylammonium bromide를 순차적으로 섞고 , 광 개시제 Irgacure 2959와 N-vinyl-pyrrolidinone을 넣어 고안한 몰드에 UV light( 250~450nm)를 30분 동안 노출시키고 PBS로 2일 동안 투석 시켰다. Alginate의 RGD부착 유무를 Ninhydrin assay와 H-NMR로 확인하고, gel 상태에서 counting방법으로 세포부착 성을 평가하였다. Ferrogel의 기공성 평가를 위해 주사전자현미경 (SEM)을 사용하였고, 인공유리체의 합성을 H-NMR과 육안으로 평가하였다.
결과: SA-R의 Ninhydrin assay에서 RGD-peptide 양이 10ug, 100ug 중에 100ug일 때 흡 광도가 더 높게 나타났고, H-NMR에서 SA에 부착된 NH2-resonance(6.8~7.2ppm picks) 를 확인 할 수 있었다. SA-R의 세포부착성에서 SA보다 약 11배 더 부착이 된 것을 확인 할 수 있었다. 또한 macro–기공의 평균 장축 사이즈는 510㎛, nano-기공의 평균장축 사이즈는 97nm로 나타났다. H-NMR에서 인공유리체의 Hyaluronic acid에 Vinyl group의 접합 (picks :5.7, 6.2 ppm)을 확인 할 수 있었고, uv 합성 후, gel 형태를 유지함을 관찰 할 수 있었다.
결론: 세포부착성을 높이기 위해 SA-R의 RGD-peptide의 양이 100ug이 보다 적합하다 고려된다. 또한 nano–porous한 ferrogel을 만들기 위한 방법으로 초임계 건조 방법이 적합한 것으로 생각된다. 약물 로딩된 ferroegl의 in vitro 약물실험 모델로써 인공유리체의 합성과 특정 몰드에 대한 적합한 성형성을 확인 할 수 있었다. 앞서 인공유리체의 MTT실험을 거쳐, 세포를 seeding하여, 세포부착성을 가지는 ferrogel을 부착시킨 후, 자기장에 따른 약물 방출을 실험이 가능할 것으로 사료된다.
방법
결과
결론
