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Proteomic approaches to defining sperm fertility in porcine
경제동물에 있어 정자의 수정능력의 예측은 매우 중요한 일이다. 그러나 현재까지 이용되고 있는 정자의 기능적 분석은 정자의 운동성, 활력, 농도 및 일반적인 형태적 분석 등과 같은 양적 형질의 평가만을 수행할 뿐 수정능력 예측을 위한 객관적이고 정확한 도구는 개발되지 못하였다. 즉, 인반적인 정자의 분석은 웅성의 수정능력을 진단하는데 있어 그 한계를 가지고 있는 실정이다. 우수 동물 및 농가의 생산력을 증진시키고 안정적인 생산체제를 구축하기 위하여 새로운 정자의 수정능력 예측법의 개발이 시급한 실정이다. 최근 보다 정확하고 객관적인 수정능력을 예측하기 위하여 정자의 hyperactivation, 수정능획득과 같은 intact-acrosome, 정자의 투명대 결합능력, 정상적 DNA의 상태 등과 같은 다양한 방법이 수행되고 있다. 그러나 이러한 방법들이 정자의 기능과 수정능력 사이의 상관관계가 매우 적기 때문에 정확한 수정능력의 예측에 있어 많은 의문이 제기되고 있다. Proteomics는 postgenome 시대에 새로운 연구로서, 생물학적 과정에 관련된 세포 mechanism을 식별하는 proteome의 질적, 양적 비교로 정의할 수 있다. 정자는 transcription이 불활성화 되어 있는 세포이므로 proteomics를 이용하여 정자의 분자적 기능을 보다 정확히 이해할 수 있다. 또한 정자 proteome의 비교 분석은 정자가 수정을 위한 수정능획득의 방법과 정자가 서로 다른 수정 능력을 가지는 원인을 이해하는데 있어 매우 중요하다. 본 연구의 목적은 돼지의 체내 수정능력을 예측하는 방법의 최적화를 통하여 새로운 예측방법을 개발하고, 나아가 정자의 수정능과 관련된 프로테옴을 동정하여 정자의 수정능력을 예측하는 바이오 마커로의 이용 가능성을 입증하고자 하였다. 본 실험의 분석 결과의 민감도를 높이기 위하여 모든 과정을 최적화 하는 과정을 거쳤으며, quality control을 실시하여 안정적인 결과를 도출하였다. 투명대를 제거한 햄스터 난자와 미성숙 돼지 난포란을 이용한 정자의 침투능력검사에 있어 heparin을 처리한 실험구에서 가장 높은 침투율을 나타냈다. 정자 침투능력검사에 있어 투명대를 제거한 햄스터 난자를 공시하였을 때 돼지의 미성숙 난포란을 이용한 결과보다 유의적으로 높은 결과를 나타냈다. 소의 동결정액을 이용하여 quality control을 실시하여 실험의 변이를 제거하였으며, 또한 암컷의 변이 요인 또한 가능한 모두 제거하였다. 최적화된 SPA (sperm penetration assay using zona-free hamster oocytes)는 돼지의 평균 산자수와 유의적인 상관관계를 나타냈으나, 수태율과는 어떠한 상관관계도 나타내지 않았다. 산자수 8마리 이하를 예측하기 위하여 Sperm Fertility Index (SFI)을 1.2로 cutoff 하였을 경우 정확성은 92%이며, 산자수 10마리 이상을 예측하기 위하여 SFI를 2.5로 정하였을 경우 96%의 정확성을 나타내어 수정능력 예측을 위한 방법으로 유용성이 입증되었다. 산자수가 낮은 group과 높은 group의 정자로부터 발현되는 단백질의 수준을 분석한 결과, 총 108개의 단백질 spot을 찾을 수 있었다. SigmaGel programe을 이용하여 spot의 농도를 분석한 결과, 25개의 단백질 spot이 서로 다르게 발현하였으며, 산자수가 낮은 정자에서 보다 높은 농도로 발현하고 있음을 알 수 있었다. 25개의 단백질 spot을 LC-MS/MS 방법을 이용하여 분석한 결과, 총 20개의 단백질을 동정할 수 있었으며, 이들 20개 단백질 중 mitochondrial trifunctional proteins이 산자수가 높은 group의 정자에서 높은 발현을 나타냈으며, PHGPx와 Arginine Vasopressin Receptor 2가 산자수가 낮은 group의 정자에서 높은 발현을 나타내었다. 이러한 결과들은 이들 방법들이 단지 정자의 수정능력을 분석하는데만 이용할 수 있는 것이 아니라 biomarker로서 정자의 수정능력을 조절하는 인자와 관련된 유전자를 발굴하는데도 유용할 것으로 사료된다.
