우리 세대는 일제강점기에서 해방된 후, 이어진 혼란기에 6․25전쟁을 치루는 등 어려운 기간을 살아 왔다. 과학자가 된다는 것은 상상하기도 어려운 때였다. 그런 때 나는 생물학자를 꿈꾸었다. 다행히 서울대학교 생물학과에 입학하여 생소한 생물학을 배웠다. 세포학, 유전학 혹은 생리학을 배우면서 더욱 더 생물학에 매력을 느꼈다. 그래서 대학원으로 진학했다. 새로 나온 항생제인 스트렙토마이신이 생쥐 백혈구 수 혹은 백혈구의 운동능에 미치는 영향을 관찰한 실험결과를 정리한 논문으로 석사과정을 마쳤다. 1956년이다. 그 때로는 매우 첨단적 과제였다. 그러나 실험실 연구는 더 이상지속하기 어려워, 종이와 연필로 가능한 생물학을 선택했다. 그것이 우리 한국인의 인구문제, 유전형질 그리고 출생성비연구였다. 차차 실험실 사정이 나아짐에 따라 실험실연구로 복귀하였다. 출생성비연구 과정에서 성분화 혹은 성결정기작에 대한 관심을 갖게 되었다. 1964년 미국인구협회 의생물학부 연구장학생으로 선발되어 미국 펜실베이니아대학교 부설생식생물학연구소에서 2년간 보냈다. 이 연구소는 기관배양연구로 독보적인 Biggers 박사가 연구소장이고, Brinster 박사, Whittingham 박사 등이 배양 중인 생쥐배아의 신진대사에 관한 연구를 집중적으로 수행하고 있었다. 나는 배양 중인 생쥐난소로부터 배란을 유도하는 실험으로 소일하였다. 배양중인 생쥐난소로부터 눈이 부실 정도의 관택을 내며 배란되어 나오는 난자를 보며 큰 감동을 느꼈다. 귀국할 때 록페재단으로 부터 약 1만5천 달러의 연구비를 얻었고, 이것으로 실험실에 기관배양시설을 꾸몄다. 시설 완비까지는 1 년여가 걸렸다. 그 사이 생쥐의 안전방을 이용한 난자의 성숙, 배아의 발생에 관한 연구로 시간을 보냈다. 생쥐 안전방이 배양액과 같은 성분이어서 배아발생연구에 매우 적절함을 알았다. 기관배양시설이 완비된 뒤 이를 이용하여 난자성숙 기작, 배아발생 및 분화에 대한 연구를 수행하였다. 1971년부터 2년간 WHO의 연구비로 두 번째 유학을 떠났다. 처음 4개월은 죤스 홉킨스 대학에서, 다음 1년 2개월은 하버드 의과대학의 인간생식생물학연구소에서 그리고 나머지 6개월은 영국 케임브리지대학 생리학연구실에서 보냈다. 하버드에 있는 동안 cAMP가 배양중인 난자의 성숙을 가역적으로 억제한다는 사실을 알았다. 케임브리지대학에서는 원거리 수송이 가능한 난자 혹은 배아의 미세관배양법을 창안하였고, 실제로 발생 중인 배아를 장거리 이송하는데 성공하였다. 나의 연구활동은 이 때가 고비가 된다. 서울대학교가 관악으로 옮긴 뒤 자연과학대학 학장을 맡고, 그 뒤 부총장, 끝내는 총장의 직책에 이른다. 대학의 행정직에 있는 동안 연구실은 그대로 유지되며, 대학원생들이 꾸준히 실험실을 지켰다. 그런 사이 실험결과도 다수 발표할 수 있었다. 교실의 연구 주제도 점차 호르몬과 연관된 분야로 옮겨졌다. 학장 재직동안 AID차관사업을 주관하며 기초과학연구 질을 향상시키는 일에 전력을 쏟았다. 1982년에 유전공학학술협의회 회장으로 선임되어 우리나라 유전공학 및 생명공학 육성에 공헌하였으며, 그 뒤 바이오산업협회 회장으로서 우리나라 바이오산업 발전에 힘썼다. 1993년부터 오늘에 이르기까지 국제백신연구소 사업에 깊숙이 관여하고 있다. 최초 유치단계 때 위원장으로, 유치 된 후에는 연구소 이사로, 혹은 소장특별고문의 직책으로 연구소 운영에 직접 관여했고, 그 뒤 한국후원회 이사장으로 그리고 최근 후원회 상임고문의 직책을 맡고 있다. 그 밖에 대통령과학기술 자문회 위원장으로, 과총회장으로, 그리고 한국과학기술한림원 원장 등으로 과학기술 발전에 헌신하였다. 돌이켜 보면 나의 반생은 발생생물학 분야의 연구에 바쳤고, 나머지 반생은 우리나라 과학 특히 생물학 분야 발전을 위하여 봉사한 기간이다.

One of challenging goals of developmental biology is understand of genetic inheritability of developmental programming. This challenging task first requires identification of all genetic factors and their functional dependences, revealing holistic view of genetic organization of cellular and organismal development. Because of high complexity of genotype as well as phenotype, genetic dissection of developmental programs could be even untouchable by combinatorial explosion of the number of possible associations. Therefore, modern genetics needs to be more systematic and predictive. Recently we proposed network-guided approach for genetics of complex traits. First, we construct probabilistic functional gene networks for cells or organisms by benchmarking and integrating heterogeneous multi-omics data that are in general publicly available. Then, using guilt-by-association, and other algorithms of network propagation of known biological information, we predict gene functions, phenotypic effect of loss-of-function, and epistatic interaction. The information can contribute to reconstruction of map between genotype and phenotype. The network-guided genetics method has been effectively applied for various organisms; from simple microbe yeast, to multicellular animal C. elegans, and to the human.

Early pregnancy loss in humans, which often occurs due to defects that occur before, during or immediately after implantation, is a worldwide social and economic concern. For successful implantation to occur in the receptive uterus, the blastocyst must also attain implantation competency. The first evidence that the state of activity of the blastocyst determines the “window” of implantation in the receptive uterus was derived from reciprocal blastocyst transfer experiments in a delayed implantation mouse model. This model is a powerful approach to define the molecular signaling components that direct blastocyst activation or dormancy. Nearly 100 mammals in seven different orders undergo delayed implantation, but the underlying mechanism remains largely unknown. There is evidence that catecholestrogens produced from primary estrogens in the uterus activate blastocysts. Another lipid signaling molecule that targets blastocysts is an endocannabinoid anandamide, which activates G-protein coupled cannabinoid receptors CB1 and CB2. Expression of CB1 in the Tr, and uterine synthesis of anandamide, suggest that endocannabinoid signaling is critical to implantation in mice. Levels of uterine anandamide and blastocyst CB1 are coordinately downregulated with the attainment of uterine receptivity and blastocyst activation, respectively, in contrast to their elevated levels in the nonreceptive uterus and dormant blastocysts. Anandamide regulates blastocyst function by differentially modulating MAPK signaling and Ca2+channelactivityviaCB1. Using delayed implantation model, a global gene expression study showed that these two different physiological states of the blastocyst are molecularly distinguishable. The main functional categories of altered genes include cell cycle, cell signaling and energy metabolic pathways. This study also showed an upregulated expression of heparin-binding EGF-like growth factor (HB-EGF) in activated blastocysts and is complementary to earlier reports of upregulated expression of its receptor ErbB1 and ErbB4 in similar blastocysts. Recently, we demonstrated that silencing of Wnt-beta-catenin signaling in mice does not adversely affect the development of preimplantation embryos to blastocysts and uterine preparation for receptivity, but, remarkably, blocks blastocyst competency to implantation. A coordinated activation of canonical Wnt-beta-catenin signaling with Cox-2-PPARd signaling pathway ensures blastocyst competency to implantation. These findings constitute novel evidence that Wnt signaling is at least one pathway that determines blastocyst competency for implantation. More insight into the molecular basis of blastocyst competency for implantation might help to improve pregnancy rates in human IVF programs.

The remarkable regenerative capacity of the adult liver provides a setting to test the functional consequences of grafting human cells generated from pluripotent stem cells. This presentation describes a procedure to differentiate hepatocytes from human embryonic stem and induced pluripotent stem cells using only defined factors. Two cell populations generated in vitro were grafted into the spleen of mice treated with the hepato-toxin carbon tetra-chloride. The population containing few hepatocytes generated few surviving cells that produced low levels of albumin and did not support regeneration of the host liver. The cells enriched in donor hepatocytes efficiently engrafted around the branches of the portal vein, expressed hepatic features for at least 5 weeks. These cells also contributed to the endogenous tissue regeneration and function of the host liver. These results show that the controlled differentiation of hepatocytes from human pluripotent cells provides new approaches to define the mechanisms of tissue regeneration and restore liver function.

수정, 착상부터 임신 후반기까지 영장류의 생식활동은 모체와 태아간 면역계의 관용과 거부의 균형에 의존하게 되며, 이런 면역반응은 부성의 major histocompatibility complex (MHC)를 가진 배아 또는 태아에 의한 면역계의 자극을 모체가 인지함으로써 시작된다. 태아에 대한 모체의 면역반응은 “면역관용, immune tolerance”이라는 자궁 특유의 면역학적 특징을 보인다. 1950년대 Medawar 등은 태아가 모체 내에서 면역계의 공격을 이기고 안전하게 성장할 수 있는 기전으로 i) 모체 면역세포가 태아항원에 대한 무반응 (anergy) 또는 면역관용을 획득한다는 가설, ii) 태아와 모체간 해부학적 장벽에 의해 모체 면역세포가 태아세포에 접근할 수 없다는 가설, 그리고 iii) 태아세포 스스로 동종항체의 발현을 억제한다는 가설 등을 제기하였다. 하지만 Medawar의 가설은 초창기 생식면역학의 기본 개념을 제시하였지만 태아항원과 모체 면역계 사이에 이루어지는 면역관용 현상을 설명하는데는 부족함이 많았다. 이후, 자연살해세포 (natural killer, NK cell), 자연살해 T 세포 (natural killer T, NKT cell), 면역조절 T 세포 (regulatory T, Treg cell), 단핵세포 (monocyte), 수지상세포 (dendritic cell), 대식 세포 (Macrophage) 등 다양한 종류의 모체 면역세포들이 면역관용에 관여한다는 연구들이 보고되었다. 이들 면역세포들은 자궁 내의 태아와 모체가 접촉하는 “태아-모체 접촉면, feto-maternal interface”에 decidual associated lymphoid tissue (DALT)라는 임신 특이의 조직학적 구조물 내에 존재하며, 태아에 대한 모체의 면역관용을 획득하는데 중요한 역할을 하고, 착상 및 임신 유지에 수반되는 혈관생성 및 영양막 (trophoblast)의 발달에 필수적인 무균성 염증반응 (sterile inflammation)을 유발하는 것으로 알려졌다. DALT에서 모체의 면역세포들과 여러 전달물질간의 복잡하고 다양한 연결망의 형성에 의한 적절한 염증반응은 배아의 착상 및 임신의 유지에 필수적인 혈관생성 및 영양막의 발달에 중요한 역할을 하는 반면 적절하지 않거나 과도하게 오랜기간 지속되는 염증반응은 급성 혹은만성 이식거부 반응과 유사한 작용을 일으켜 태반의 성장, 태아의 성장 및 발달에 심각한 장애를 초래하며, 착상부전(repeated implantation failure), 습관성 유산 (recurrent spontaneous abortion), 임신 자간증 (preeclampsia) 등 그 병인이 유사한 생식능력장애 (defect of reproductive performance)의 원인이 될 수 있다. 인간 탈락막 또는 자궁내막에 존재하는 면역세포는 극소수의 백혈구만 존재하며, 주로 세가지 아형의 면역세포 즉, T 림프구, 대식세포, 자궁 내 자연살해세포 등이 주를 이루고, B 림프구가 거의 없는 점 등에서 말초혈액의 면역세포의 구성과 많은 차이가 있다. 그간의 연구결과를 종합해 보면 착상과 임신의 유지를 위해서는 태아의 동종항원에 대한 모체의 면역반응의 균형이 필수적이며, 이러한 균형에 문제가 생겨 과도한 면역반응이 유도될 경우, 태반의 성장에 심각한 장애를 초래하여 착상부전 (recurrent implantation failure, RIF)이나 반복적 유산 (recurrent spontaneous abortion, RSA), 전자간증과 같은 생식부전 (reproductive failure)의 원인이 될 수 있다. 임신 중 태아에 대한 모체의 면역에 관여하는 세포들 중 NK cell의 착상과 임신을 유지하는 과정에서의 역할에 대한 연구가 최근 비교적 활발히 이루어지고 있다. 특히, NK cell의 적절한 면역반응에 대한 조절을 실패는 습관성 유산, 불임 (infertility), 그리고 전자간증 (pre-eclampsia) 같은 병리학적 기전들과 관련이 있다고 보고되고 있으며, 특히, 근래에 습관성 유산의 원인과 관련하여 NK cell에 대한 많은 연구가 이루어지고 있다. 말초혈액에서 NK cell(periopheral blood NK cell, pbNK cell)은 대부분이 CD56, CD16 세포 표면 항원을 발현하고 강한 세포 독성 (cytotoxicity)을 가지는 반면, CD56 세포 표면 항원은 강하게 발현하지만 CD16 세포 표면 항원은 발현하지 않는 자궁 내 NK cell (decidual NK cell, dNK)은 세포독성은 약하고 다양한 종류의 cytokine을 분비하는 특징을 가지는 것으로 보고되고 있다. 여러 문헌에 의하면, 정상 임신 초기에는 pbNK cell의 활성도와 분획은 감소하는 반면, 습관성 유산 환자에서는 증가되어 있고, 임신을 확인하기 전에 측정한 경우 역시 습관성 유산의 경력이 있는 여성에서 pbNK cell의 비율이 높게 나타나 pbNK cell의 세포용해 활성도 또는 분획의 증가는 연속되는 임신에서 습관성 유산의 위험성을 증가시키는 원인으로 보고되었으며, 그 결과는 NK cell의 면역작용에 대한 성공적인 조절이 임신의 성공 및 유지에 중요한 요소라는 결론이 제시되었다. 한편, 유산이 진단된 유산산물의 탈락막 내에서 CD56+CD16－ 형태의 dNK cell이 높게 검출되어 dNK cell의 작용부위가 착상부위임을 보고하였으며, 결국 습관성 유산 및 착상 부전 등 NK cell에 의한 생식 부전의 진단에는 자궁 내의 NK cell의 세포용해 활성도와 분획의 분석이 정확한 진단에 도움이 될 것으로 여겨지지만, 검체 채취의 윤리성과 검사방법의 어려움으로 연구 수행에 많은 제한이 있다. 본 강의에서는 임신의 성공과 유지에 관련 하여 NK cell의 역할 및 착상부전, 습관성 유산을 예측하는데, NK cell의 진단적 기능에 대해 문헌고찰 및 저자의 연구결과를 중심으로 논의하고자 한다.

Recent genomic evidences from unfractionated embryonic stem cell (ESC) cultures have demonstrated high levels of concomitant activating (H3K4me3) and repressive (H3K27me3) histone methylations, termed “bivalent marks”, at lineage specific gene loci, demonstrating that all cells residing within the cultures are developmentally equipotent. However, this dogma has been challenged, indicating that ESC cultures are heterogeneous, with individual cells displaying dynamic metastability and failed to make a connection with the variations between cell lines, a broad spectrum of differentiation, continuous phenotypic oscillation, and the expression of lineage specific genes in undifferentiated state. Recently, functional in vitro assays via fractionation of ESC cultures based on comparable expression of some phenotypes (c‐KIT, A2B5, SSEA3, Nanog, Rex‐1, IGFR1, and Stella) revealed a plastic gradient of clonogenicity and lineage specification within ESC cultures reflected by the presence of bivalent marks, which are resolved down to activating “monovalent marks”. More interestingly, dynamic heterogeneity represents a conserved feature on both mouse ESCs and human ESCs as being essentially required for self‐renewal and, more importantly, differentiation. However, it is the most substantive obstacle to control and specify ESCs into desirable cell types. Mostly, differentiation from ESCs has been evaluated by measuring the responses of whole EB populations under the specific inducible conditions, making it difficult to identify, which cell populations are dominantly contributing to differentiated progeny from ESCs. Therefore, further identification of novel transcriptional and phenotypic markers may allow for the isolation and enrichment of more promising target cells for stem cell‐based clinical therapy.

경제동물에 있어 정자의 수정능력의 예측은 매우 중요한 일이다. 그러나 현재까지 이용되고 있는 정자의 기능적 분석은 정자의 운동성, 활력, 농도 및 일반적인 형태적 분석 등과 같은 양적 형질의 평가만을 수행할 뿐 수정능력 예측을 위한 객관적이고 정확한 도구는 개발되지 못하였다. 즉, 인반적인 정자의 분석은 웅성의 수정능력을 진단하는데 있어 그 한계를 가지고 있는 실정이다. 우수 동물 및 농가의 생산력을 증진시키고 안정적인 생산체제를 구축하기 위하여 새로운 정자의 수정능력 예측법의 개발이 시급한 실정이다. 최근 보다 정확하고 객관적인 수정능력을 예측하기 위하여 정자의 hyperactivation, 수정능획득과 같은 intact-acrosome, 정자의 투명대 결합능력, 정상적 DNA의 상태 등과 같은 다양한 방법이 수행되고 있다. 그러나 이러한 방법들이 정자의 기능과 수정능력 사이의 상관관계가 매우 적기 때문에 정확한 수정능력의 예측에 있어 많은 의문이 제기되고 있다. Proteomics는 postgenome 시대에 새로운 연구로서, 생물학적 과정에 관련된 세포 mechanism을 식별하는 proteome의 질적, 양적 비교로 정의할 수 있다. 정자는 transcription이 불활성화 되어 있는 세포이므로 proteomics를 이용하여 정자의 분자적 기능을 보다 정확히 이해할 수 있다. 또한 정자 proteome의 비교 분석은 정자가 수정을 위한 수정능획득의 방법과 정자가 서로 다른 수정 능력을 가지는 원인을 이해하는데 있어 매우 중요하다. 본 연구의 목적은 돼지의 체내 수정능력을 예측하는 방법의 최적화를 통하여 새로운 예측방법을 개발하고, 나아가 정자의 수정능과 관련된 프로테옴을 동정하여 정자의 수정능력을 예측하는 바이오 마커로의 이용 가능성을 입증하고자 하였다. 본 실험의 분석 결과의 민감도를 높이기 위하여 모든 과정을 최적화 하는 과정을 거쳤으며, quality control을 실시하여 안정적인 결과를 도출하였다. 투명대를 제거한 햄스터 난자와 미성숙 돼지 난포란을 이용한 정자의 침투능력검사에 있어 heparin을 처리한 실험구에서 가장 높은 침투율을 나타냈다. 정자 침투능력검사에 있어 투명대를 제거한 햄스터 난자를 공시하였을 때 돼지의 미성숙 난포란을 이용한 결과보다 유의적으로 높은 결과를 나타냈다. 소의 동결정액을 이용하여 quality control을 실시하여 실험의 변이를 제거하였으며, 또한 암컷의 변이 요인 또한 가능한 모두 제거하였다. 최적화된 SPA (sperm penetration assay using zona-free hamster oocytes)는 돼지의 평균 산자수와 유의적인 상관관계를 나타냈으나, 수태율과는 어떠한 상관관계도 나타내지 않았다. 산자수 8마리 이하를 예측하기 위하여 Sperm Fertility Index (SFI)을 1.2로 cutoff 하였을 경우 정확성은 92%이며, 산자수 10마리 이상을 예측하기 위하여 SFI를 2.5로 정하였을 경우 96%의 정확성을 나타내어 수정능력 예측을 위한 방법으로 유용성이 입증되었다. 산자수가 낮은 group과 높은 group의 정자로부터 발현되는 단백질의 수준을 분석한 결과, 총 108개의 단백질 spot을 찾을 수 있었다. SigmaGel programe을 이용하여 spot의 농도를 분석한 결과, 25개의 단백질 spot이 서로 다르게 발현하였으며, 산자수가 낮은 정자에서 보다 높은 농도로 발현하고 있음을 알 수 있었다. 25개의 단백질 spot을 LC-MS/MS 방법을 이용하여 분석한 결과, 총 20개의 단백질을 동정할 수 있었으며, 이들 20개 단백질 중 mitochondrial trifunctional proteins이 산자수가 높은 group의 정자에서 높은 발현을 나타냈으며, PHGPx와 Arginine Vasopressin Receptor 2가 산자수가 낮은 group의 정자에서 높은 발현을 나타내었다. 이러한 결과들은 이들 방법들이 단지 정자의 수정능력을 분석하는데만 이용할 수 있는 것이 아니라 biomarker로서 정자의 수정능력을 조절하는 인자와 관련된 유전자를 발굴하는데도 유용할 것으로 사료된다.

Ligand-bound nuclear receptors (NRs) recruit coactivators such as members of the p160 steroid receptor coactivator (SRC) family and cyclic AMP responsive element binding protein (CREB)-binding protein (CBP) to specific enhancer elements and activate target gene transcription. In the present study, we isolated a novel SRC from the sea urchin Strongylocentrotus nudus (SnSRC) by using the ligand-binding domain of retinoid X receptor as a bait in a yeast two-hybrid screening. The SnSRC (1992 amino acids) interacted with several NRs, including sea urchin estrogen receptor-related receptor (ERR), human and masu salmon estrogen receptors (ERα), mouse ERRγ, rat glucocorticoid receptor α, and rat thyroid receptor β. Furthermore, preferential interacting domains for ERα in the SnSRC are located in the central LxxLL motifs, revealed by the truncation and mutagenesis studies. Interestingly transient knockdown of the SnSRC gene in the sea urchin embryo using morpoholino antisense RNA induced abnormal phenotypes at gastrulation stage such as the lack of primary invagitation and exogastrulation. Together, the present study identified a novel steroid receptor coactivator in an invertebrate species sea urchin and demonstrated its pivotal role in sea urchin embryogenesis. It will be helpful to uncover evolutional and functional origin of the vertebrate counterpart and the detailed function of steroid receptor coactivator during early embryogenesis.

The anandamide signaling plays various roles in directing reproductive processes. Mouse embryos are shown to express high levels of CB1 receptor (CB1R). It has recently been shown that an analog of anandamide induces autophagy-mediated cell death through stimulation of ER stress response in glioma cells. Since adverse effects of high levels of anandamide agonists on embryo development and implantation are well known, we hypothesized that anandamide mediates an autophagic response in embryonic cells as in cancer cells via highly abundant CB1R on embryos. We tested this hypothesis by using a stable anandamide agonist, Methanandamide (MET) in three embryonic cell systems, i.e., mouse embryonic fibroblasts (MEF), trophoblast stem (TS) cells, and preimplantation embryos from mice. RT-PCR, immunofluorescence staining, and Western blot analysis were used to examine the effects of anandamide on autophagy in these systems. In MEF cells, the conversion of LCI to LCII was heightened by methanandamide (MET), and AM251, a selective CB1 antagonist partially reversed the effects of MET. Treating MEF cells with a high level of MET induces clustering of GFP-LC3, seen as large puncta throughout the cytoplasm. At 28 nM concentration, MET also weakly increased LC3II in TS cells. When MET was injected to day 4 pregnant mice, autophagy was increased in blastocysts in utero as demonstrated by the increased number of LC3 puncta. Formation of numerous autophagic vacuoles was also confirmed by electron microscopic observation. In conclusion, this work suggests that the anandamide-CB1 signaling pathway may be one inducer of autophagy in embryonic cells.

The development of humanized culture system of human embryonic stem cells (hESCs) hold promise for therapeutic applications. However, conventional culture system contain animal-derived components such as fetal bovine serum and mouse embryonic fibroblasts that bear a risk of transmitting non-human pathogens and incorporation of non-human immunogenic molecules to hESCs. In this study, we developed an efficient xeno-free hESCs culture system using humanized materials, the CELLstartTM, human foreskin feeder and xeno-free medium containing knockOutTM SR XenoFree (XF-medium) without animal-derived material. The hESCs were gradually adapted to the XF-medium; 25:75, 50:50, 75:25 and 100:0. Two karyotypically normal hESC lines, SNUhES4 and H1, were used for the experiments of xeno-free culture condition. The attachment rates at xeno-free culture system were 52.6±12.4%, 67.0±16.6%, 59.0±13.9%, 28.3±2.9% in SNUhES4, 79.3±5.4%, 53.8±20.9%, 69.4 ±6.4%, 59.8±12.6% in H1 and the spontaneous differentiation rates were 42.2±12.7%, 31.4±2.9%, 40.8±14.5%, 55.2±35.5% in SNUhES4, 35.6±8.5%, 36.4±13.5%, 48.4±7.8%, 80.1±6.0% in H1 in the first four passage. Although the attachment rates were low and the spontaneous differentiation rates were high compared to that of conventional system in the early passages using this humanized culture condition, hESCs in this culture condition were found to maintain hESC characterizations; morphology, expression of cell surface markers and stable karyotype. Our results indicate that simplified compositions of humanized culture system can be applicable to the further optimization for a xeno-free culture of hESCs without the loss of pluripotency and contamination from xenogenic sources.

Human embryonic stem cells (hESCs) have the potential for use in regenerative medicine and in the field of basic research. Therefore, effective cryopreservation and storage of hESCs are important for preservation of newly established cell line for various purposes. Despite poor survival and slow recovery after thawing, the conventional slow freezing method is most commonly used for cryopreservation of hESCs due to its simplicity and ease of use for freezing a large number of hESCs appropriate to clinical applications. Here we controlled the clump size (Group Ⅰ; 400～450 ㎛, Group Ⅱ; 800～900 ㎛, and Group Ⅲ; 1500～1700 ㎛) of hESCs at 5 days after plating using a glass pipette during cryopreservation in order to obtain a larger amount of hESCs after thawing. Attachment rates differed significantly (P<0.05) in each of the three groups and the average of attachment rate of GroupⅡ was highest in SNUhES4 and H1. In particular, the attachment rate of Group Ⅱ in SNUhES3 showed a significant improvement with ROCK inhibitor Y-27632. These results indicate that clump size and cell-cell adhesions of GroupⅡ are appropriate for cryopreservation compared to the Group Ⅰ and Group Ⅲ. This method increased cell viability and reduced the recovery time leading to various experiments, and therefore has an advantage for use with hESCs like newly established in particular. We demonstrated that use of this effective cryopreservation method with control of the clump size of hESCs can effectively improve the attachment rate and survival of post-thaw hESCs with and without Y-27632.

The human eyelid adipose-derived stem cells (HEACs) are known as a candidate source for stem cell-based therapy. HEACs possess the ability to proliferate in vitro and multipotency to differentiate into adipogenic, osteogenic and chondrogenic cells. To be used later than the time of collection, a long-term storage is needed. In this study, we investigated stem cell characteristics after cryopreservation of HEACs for 6 months and 1 year in liquid nitrogen. Frozen-thawed stem cells have shown that cumulative cell and doubling numbers were similar to those of fresh HEACs. After thawing, HEACs expressed stem cell-related genes of SCF, NANOG, OCT4, and TERT, ectoderm-related genes of NCAM and FGF5, mesoderm/endoderm-related genes of CK18 and VIM. They also consistently expressed transcripts of the immune-related genes of HLA-ABC and β2M. To induce mesodermal differentiation, cell were cultivated in adipogenic, osteogenic or chondrogenic medium for 2～3 weeks. After each differentiation culture, HEACs expressed adipocyte-, osteocyte- and chondrocytespecific genes. They were also stained with Oil red O, von Kossa, or alcian blue, revealing adipogenic, osteogenic, or chondrogenic character, respectively. The results suggest that long-term storage up to 1 year do not affect their biological properties, HEACs may be suitable for clinical application on cell-based therapies.

We previously reported that purified hepatocyte-like cells derived from human embryonic stem cell (hESC) promoted the liver tissue recovery not only by cell replacement, but also by delivering proteins (secretome) that enhance endogenous host liver regeneration. In this study, we investigated possible therapeutic effects of secretomes obtained from undifferentiated hESC and mesenchymal stem cell (hMSC), and explored the underlying mechanism in a mouse model of chronic liver injury. Mice pre-intoxicated with dimethylnitrosamine (DMN) were treated with single intraperitoneal injection of secretome or medium used to support the growth of hESCs or hMSCs. Both hESC- and MSC-secretomes induced robust host liver regeneration, as determined by biochemical and histological analyses. The expression of MMP2 was significantly increased in the liver that received hESC- or hMSC-secretome, compared to control groups. In contrast, expression of α-SMA, a hallmark of activated hepatic stellate cells, was profoundly decreased after administration of both secretomes. These results suggest that hESCs and MSCs may release soluble factors that support the host tissue regeneration of chronically injured liver.

Lhx8 is a member of the LIM-homeobox transcription factor family expressed in the mouse ovary. We discovered that Lhx8 knockout females lose oocytes within 7 days after birth. Lhx8–/–ovaries fail to maintain the primordial follicles and growing follicles. Lhx8–/–ovaries misexpress numerous oocyte-specific genes such as H1foo and Nlrp14. The molecular mechanism of there gulation of Lhx8 in the oocyte has not been described. We examined to characterize Lhx8 DNA binding elements and to identify its direct target genes in the oocyte. CAST was performed using glutathione transferase Lhx8 homeodomain fusion protein (GST-LHX8HD). A 15-bp random sequence flanked by 20-bp of fixed sequences were incubated with purified GST-LHX8HD protein. Unbound DNA was washed with binding reaction buffer. Bound DNA was eluted and re-amplified by PCR for the next round of CAST. Final PCR products were cloned and sequenced to derive consensus binding sequence. EMSA was performed using 32P-labeled oligomers. Binding reactions were conducted by incubating 32P-labeled probes with purified protein. Dual luciferase assays were carried out with extracts of total HEK293 cell which was transfected by the pGL4-promoter vector containing three artificial repeats of LBE(3xLBE-Luc) and overexpression vector carrying the Lhx8 homeodomain as recommended by Promega. We identified several cis-acting sites, TGATTG as Lhx8 DNA binding elements (LBE) using a library of randomly generated oligonucleotides by CAST. EMSA reslut shows that Lhx8 preferentially binds to the oligomer including Lhx8 binding element (TGATTG) with high affinity. In addition, we found that the relative luciferase activity of reporter construct containing three copies of TGATTG was increased by 2.3-fold with Lhx8 overexpression. These results suggest that Lhx8 preferentially binds Lhx8 DNA binding element, TGATTG, and can transactivate reporter genes through the LBE. The transcription of Lhx8 target gene in oocytes directly might be regulated by its during early folliculogenesis.

Protein arginine methyltransferase (PRMT) family 단백질은 히스톤 H3의 arginine 잔기를 메틸레이션 시켜줌으로써 chromatin remodeling을 유발하여 다양한 유전자의 전사를 활성화시켜 주는 것으로 알려져 있다. Coactivator-associated arginine methyltransferase 1 (CARM1/PRMT4)이 그 중의 하나로, 이는 발생과정에서 폐세포로의 분화에 관여하는 것으로 알려져 있으며, 세포의 종류에 따라서 지방세포와 근육세포로의 분화에 영향을 줄 뿐만 아니라, 생쥐 배아줄기세포의 전분화능 유지에도 관여한다는 연구 보고가 있다. 그러나 CARM1이 인간 중간엽 줄기 세포 (hMSCs)에 어떤 영향을 미치는지에 대해서는 현재까지 알려진 바가 없다. 따라서 본 연구에서는 인간 중간엽 줄기세포에 CARM1 단백질을 직접 도입함으로써 변화되는 유전자의 발현 양상을 관찰하였다. 먼저, CARM1 단백질에 세포침투단백질 (cell-penetrating peptide) 서열을 접합시킴으로써, CARM1 단백질이 효율적으로 세포 내로 도입되도록 하였으며, 그 결과 CARM1 단백질이 6시간 내에 충분히 세포막을 통과하여 세포질 및 핵 내로 이동하며, 24시간 내에는 대부분의 단백질이 핵 내에 존재하는 것을 관찰하였다. 또한 도입된 CARM1 단백질이 히스톤 H3의 arginine 잔기를 메틸화시키는 것을 확인하였다. 이렇게 순수분리 정제된 재조합 CARM1 단백질의 처리 후, chromatin remodeling이 일어난 인간 중간엽 줄기세포의 유전자 발현 변화 양상을 microarray를 통해 확인한 결과, 지방세포, 골세포, 근육세포, 신경세포, 그리고 췌장세포 분화에 관여하는 전체 유전자의 약 35～45%의 유전자에서 발현양상의 변화가 나타났다. 따라서 본 연구는 재조합 CARM1 단백질의 세포 내 직접 도입이 CARM1 유전자의 도입으로 우려되는 문제들을 보완하면서도 CARM1 단백질 본연의 기능을 효과적으로 수행한다는 것을 보여주며, 생체 친화적 단백질에 의한 인간 중간엽 줄기세포의 유전자 발현 양상의 변화를 통해 그의 분화와 관련한 임상적 이용의 가능성을 보다 높일 수 있다는 점을 시사한다.

In particular, maternal prostacyclin (PGI2) is critical for embryo implantation and the action of PGI2 is not mediated via its G protein-coupled membrane receptor, IP, but its nuclear receptor, peroxisome proliferator-activated receptor δ (PPARδ). Recently, several studies have shown that PGI2 enhances blastocyst development and/or hatching rate in vitro, and subsequently implantation and live birth rates in mice. However, the mechanism by which PGI2 improves preimplantation embryo development in vitro remains unclear. Using molecular, pharmacologic and genetic approaches, we show that PGI2-induced PPARδ activation accelerates blastocyst hatching in mice. mRNAs for PPARδ, RXRs (heterodimeric partners of PPARδ) and PGI2 synthase are temporally induced after zygotic gene activation and their expression reaches maximum levels at the blastocyst stage, suggesting that functional complex of PPARδ can be formed in the blastocyst. Carbaprostacyclin (cPGI, a stable analogue of PGI2) and GW501516 (a PPARδ selective agonist) significantly accelerated blastocyst hatching but did not increase total cell number of cultured blastocysts. Whereas U51605 (a PGIS inhibitor) interfered with blastocyst hatching, GW501516 restored U51605-induced retarded hatching. In contrast to improvement of blastocyst hatching by PPARδ agonists, PPAR antagonists significantly inhibited blastocyst hatching. Furthermore, deletion of PPARδ at early stages of preimplantation mouse embryos caused delay of blastocyst hatching, but did not impair blastocyst development. Taken together, PGI2-induced PPARδ activation accelerates blastocyst hatching in mice.

The Egr family of zinc finger transcription factors consisting of 4 members (Egr1 to Egr4) regulates critical genetic programs involved in cellular growth, differentiation, and function. They are co-ex-pressed in many different tissues, suggesting that they may have some redundant functions. While it is clear that estrogen regulates Egr1 in estrogen sensitive breast cancer cells, function of Egr1 and mechanisms by which estrogen (E2) and/or progesterone (P4) regulates Egr1 in uterus still remain unexplored. Thus, we have examined regulatory mechanisms by which Egr1 is regulated in the uterus and abnormal uterine phenotypes of Egr1(－/－) mice. Eight-week-old female mice were ovariectomized (OVX) and rested for a week. Uteri of OVX mice treated with various concentrations of E2 and/or other hormones were collected at 2 h after hormone treatment unless otherwise indicated. ICI 182,780 [estrogen receptor (ER) antagonist] or RU486 [progesterone receptor (PR) antagonist] was injected to OVX mice 30 min prior to hormone treatments. OVX Egr1(+/+) and Egr1(－/－) mice were treated with E2 and/or P4 to examine expression patterns of genes important for estrogen responses, and steroid hormone-induced cell proliferation in the uterus. Collected uteri were utilized for RT-PCR, realtime RT-PCR, Western blotting and histological analyses. Egr1 mRNA was rapidly induced with the highest level at 2h after E2 treatment and gradually deceased to basal levels at 12 h. Pretreatment of ICI 182,780 significantly reduced E2-induced increase of Egr1. However, an agonist for GPR30, a membrane estrogen receptor failed to induce mRNA expression of Egr1, suggesting that E2-dependent Egr1 transcription is mainly regulated via nuclear estrogen receptor, ER. P4 effectively dampened E2-dependent Egr1 transcription and its antagonistic effects were partially interfered with RU486 pretreatment. Histological analyses with BrdU incorporation experiments showed that vascular permeability (an early estrogen response) but not cell proliferation (a late response) was significantly impaired in the uteri of E2 treated OVX Egr1(－/－) mice. Interestingly, some genes involved in early estrogen responses such as Bip and HIF-1a but not those in late responses are dysregulated in uteri of Egr1(－/－) mice. Collectively, our results show that E2 transiently induces Egr1 via activation of nuclear ER. P4 antagonizes E2-dependent Egr1 regulation via PR. Impaired early estrogenic responses in Egr1(－/－) uteri could be due to aberrant gene expression affected by loss of Egr1 which act as a master regulator of estrogen actions in the uterus.-ex

남성의 체내에 미량의 estrogen이 존재하며, 정소와 부정소에 estrogen receptor (ERα, β)가 발현한다. Estrogen은 ERα와 ERβ를 통해 세포의 생존, 증식 및 분화를 조절한다. ERα는 정소에서 스테로이드형성, 정자형성 부정소에서 정자 성숙 및 부정소 체액항상성 조절기능을 수행할 것으로 추측된다. 본 연구에서는 출생 직후, 생후 1, 2, 4, 8주령의 생쥐 정소 및 부정소를 획득한 후 정량적 RT-PCR, Western blot, 면역조직화학법을 이용하여 ERα의 발현을 확인하였다. 생쥐의 주령별 정소와 부정소에서 ERα mRNA의 발현분석 결과, 정소에서는 신생부터 1주령까지 발현량이 급격히 증가하였으며 4주령부터 약간 감소하였다. 부정소에서는 신생부터 4주령까지 비슷한 발현량을 보였으며, 8주령에서 발현량이 증가하였다. Western blot 결과, 8주령 부정소에서 efferent duct에서 가장 강하게 발현하였고, 부정소 체부에서 가장 적게 발현되었다. 면역조직화학법을 통한 ERα의 발현부위분석 결과, 정소에서 ERα 단백질은 주로 Leydig cell과 peritubular cell에서 발현하였다. 부정소에서는 efferent duct와 두부 부정소에서 가장 강하게 발현되었으며, 두부 부정소의 principal cell과 narrow cell에서 강하게 발현되었다. 체부 부정소에서는 basal cell과 clear cell에서 발현하였다. 미부부정소에서는 stromal cell에서 강하게 발현하였고, basal cell과 clear cell에서도 발현되었다. ERα는 정소에서 스테로이드형성 및 Leydig cell의 증식에 관여하며, 부정소에서 정자의 성숙 및 저장에 관여할 것으로 사료된다.

성장호르몬 치료는 성장호르몬 결핍증, 터너증후군, 만성 신부전증, 프라더 월리 증후군 등으로 인해 성장장애가 온 아동인 경우 수행되지만 성장호르몬의 과다 투여로 인한 부작용에 대해서는 여전히 논란의 여지가 많은 상황이다. 본 연구에서는 유아기 성장호르몬의 노출이 사춘기 시기의 성성숙 및 생식 내분비계에 미치는 영향에 대하여 알아보고자 하였다. PND21부터 PND28까지 1주일간 각각 10마리의 수컷 SD rat에 Growth hormone (rhGH) 1, 2 IU/kg/day를 피하주사하였다. 대조군 (10마리)으로는 식염수 0.1ml을 투여하였으며, 체중 변화를 매일 0.1g 단위로 측정하며 기록하였다. 사춘기 도래시기의 변화를 분석하기 위하여 음경꺼풀분리 (preputial separation) 일자를 기록하였으며, 사춘기 (PND28) 시기의 주요 생식기관의 중량변화 및 조직학적 변화를 분석하였다. 시상하부에서 사춘기 조절에 관여하는 kiss1 및 GnRH의 발현 변화를 확인하였고, 혈중 testosterone 농도 및 정소에서 스테로이드호르몬 분비에 관여하는 유전자들의 발현 변화를 확인하였다. 정소조직 내 Leydig cell의 면적 및 세포수를 이미지 분석 시스템을 이용해 분석하였다. 모든 GH 처리군에서 유의적인 체중 증가가 나타났으며, 2IU 처리군에서 음경꺼풀이 대조군에 비해 조기에 분리되었다. GH 2IU/kg 처리군에서 정소와 부정소, 정낭샘 및 음경꺼풀샘의 중량이 유의적으로 증가하였고, 시상하부에서 kiss1 및 GnRH의 발현이 유의적으로 감소하였다. 혈중 testosterone의 농도가 2IU 처리군에서 유의적으로 증가하였으며, 정소에서 스테로이드 호르몬 합성 유전자인 17β-HSD, SF-1발현이 증가하였다. GH 처리군에서 Leydig cell의 면적과 세포수가 유의적으로 증가하였다. 성장호르몬에 노출될 경우 개체의 성장 및 기관 발달이 촉진되지만, 과다 노출될 경우 steroid의 합성과 분비조절 기능의 변형이 예상되며, 사춘기 조기 도래를 유발할 가능성이 있는 것으로 사료된다.

Foxi1, a forkhead family of transcription factor, in narrow and clear cells in epididymis is required for male fertility through regulating transcription of vacuolar H+-ATPase. To understand the regulation of Foxi1 gene activation in epididymis, the effects of steroids and their receptor antagonists and testicular factors on the expression of Foxi1 in epididymal segments were examined in mouse. Epididymis were sampled from adult mice following injections of ICI 182,780 (5mg/head, 2 times for 15 days), dexamethasone (DEX, 0.1,1,10ug/kg/day for 5 days) or oral administration of flutamide (FLM, 100mg/kg/day for 10 days). Otherwise, adult mice were orchidectomized (ORX), rested for 2 weeks, and received testosterone propionate(TP, 3mg/kg/day) for 7 days. In addition, adult male mice were subjected to efferent duct ligation (EDL) and epididymis was collected after 15 days. To study estrogen regulation of Foxi1 gene activation via estrogen receptor α (ESR1), Foxi1 expression was examined in ESR1 knock-out mice epididymis. Expression and subcellular localization of Foxi1 was analyzed by realtime RT-PCR and immunohistochemistry. To search transcription factor binding in the mouse Foxi1 gene promoter, in silico analysis was performed using TESS, TFSEARCH, and Gene-Regulation. ICI 182,780 significantly decreased Foxi1 mRNA levels in caput and corpus but increased in cauda epididymis. Foxi1 mRNA levels in caput epididymis of ESR1 KO mice were significantly lower than those of WT mice, but no significantly changed in corpus and cauda epididymis. Taken together, estrogen differentially regulates Foxi1 gene expression in epididymis. In ORX mice, Foxi1 mRNA levels were significantly increased in epididymis, and which was abrogated by TP. Though FLM did not significantly alter the Foxi1 mRNA levels, androgen may affect Foxi1 gene expression in epididymis. DEX significantly decreased Foxi1 mRNA levels in caput and corpus epididymis at 0.1ug/kg/day and in cauda epididymis at 1ug/kg/day, suggesting that glucocorticoid may negatively regulate Foxi1 gene expression. No significant change in Foxi1 mRNA levels was found after EDL. Foxi1 immunoreactivity was found in the nuclei of narrow cells of caput epididymis including initial segment and clear cells of corpus and cauda epididymis. Of note, in ORX mice, Foxi1-positive narrow cells and clear cells were increased, and which was abrogated by TP. In silico analysis revealed the presence of putative binding sequences for ESR1, AR, and GR in the 5’ upstream region from the Foxi1 promoter. In conclusion, the expression of Foxi1 in narrow cells in caput epididymis might be positively regulated by estrogen via ESR1, which was different from estrogen–ESR signaling in clear cells in corpus and cauda epdididymis. Androgen and glucocorticoid may negatively regulate expression of Foxi1 in all epdididymial segments.