Early growth response-1(Egr-1)은 zinc finger transcription factor로 세포분화, 생장 및 사멸을 조절한다. Egr-1 KO 수컷 생쥐의 정소에서는 maturation arrest, Sertoli cell only 등의 비정상 세정관이 유의적으로 증가한다. Glial cell Derived Neurotrophic Factor(GDNF)는 고농도에서는 줄기세포 자가 재생, 저농도에서는 정원세포를 분화효과를 갖는다. 본 연구에서는 발생중인 생쥐 정소에서 Egr-1 발현을 확인하고, GDNF에 의한 spermatogonial stem cell의 stemness 조절 신호전달 기작연구의 일환으로 Egr-1 유도현상을 규명하고자 하였다. ICR 생쥐의 생후 1, 2, 4, 8주령 정소를 획득하여 RT-PCR과 면역조직화학법을 통해 Egr-1 발현을 확인하였다. 한편 생쥐의 생후 5일된 정소를 획득하여 THY1 항체를 이용한 MACS 방법으로 spermatogonial stem cell을 분리하였다. GDNF(1, 100 ng/ml)를 0, 0.5, 1, 2, 6시간 처리하고 Egr-1 mRNA 발현을 분석하였다. 생후 3~12개월령 Egr-1 KO 수컷 생쥐와 Hetero 수컷 생쥐의 정소를 획득하여 H&E 염색 후 정소 내 seminiferous tubule을 비교하였다. Egr-1 mRNA는 생후 1, 2주령까지 높게 발현하다가 성숙함에 따라 발현이 감소하였다. 면역조직화학적 분석 결과, Egr-1은 gonocytes, (stem)spermatogonia, 분열 중인 peritubular cells과 Leydig cells에서 발현하였다. MACS로 분리한 spermatogonial stem cell에서 GDNF 처리 시 Egr-1 mRNA 발현은 0.5시간과 1시간에 유의적으로 증가하였고, 6시간 후 다시 감소하였다. Egr-1은 정소에서 gonocytes, spermatogonial stem cells, peritubular cells, Leydig cells에서 주로 발현된다. MACS로 분리한 spermatogonial stem cell에서 GDNF에 의해 짧은 시간에 Egr-1 mRNA가 유도되는 것으로 보아, Egr-1은 GDNF에 의한 spermatogonial stem cell의 niche 유지에 중요한 기능을 담당하는 상위 전사인자로 사료된다.

혈액 정소 장벽은 정소내에 있는 세정관과 Sertoli cell 사이에 존재하는 물리적 장벽이고, 혈액 부정소 장벽은 부정소 내의 상피세포간의 밀착결합에 의한 장벽이다. 이러한 혈액 정소 장벽과 혈액 부정소 장벽은 내강과 외부 사이의 물질수송에 관여하는 역할을 한다. 정소와 부정소에서는 정자의 형성과 성숙이 일어나기 때문에 이러한 장벽을 통한 물질수송의 조절은 정자의 형성과 성숙에 영향을 미친다. 본 연구에서는 Lipopolysaccharide(LPS)를 투여하여 전신성 염증반응을 일으킴으로서 염증반응에 의한 혈액정소장벽과 혈액부정소장벽의 분자적인 변화와 확산장벽기능의 변화를 조사하였다. 생후 8주령 생쥐에 LPS와 식염수를 각각 투여 후 24시간 뒤 정소 및 부정소를 적출하여 무게측정 뒤 정량적 realtime RT-PCR 방법을 통해 혈액정소장벽과 혈액부정소 장벽 현성에 관여하는 밀착결합 유전자(CAR, Claudins, JAMs, Occludin, Tricellulin, ZO-1) mRNA와 단백질 발현을 분석하였다. 실험군과 대조군에서 적출한 정소와 부정소의 무게를 측정하여 평균을 낸 결과, 무게가 유의적으로 증가하였다. 염증반응의 여부를 확인하기 위하여 TNF-α, IL-1β, IL-5, IL-18의 mRNA를 realtime RT-PCR로 분석한 결과, TNF-α와 IL-5의 발현이 유의적으로 증가하였다. 정소에서 밀착결합 유전자의 realtime RT-PCR 결과, Cldn 1, 2, 4 mRNA의 발현은 대조군보다 LPS를 복강주사한 실험군에서 유의적으로 증가하였다. JAM3 mRNA 발현은 유의적으로 증가하였고, Occludin과 ZO-1 mRNA 발현은 큰 차이를 보이지 않았다. CAR의 경우, isoform 중 Exon 7번이 마지막인 long form의 mRNA 발현이 유의적으로 증가하였고, Tricellulin의 경우, isoform 중 long form과 mid form의 mRNA 발현이 유의적으로 증가하였다. 부정소에서는 Claudin 유전자와 JAM 유전자중 대부분이 증가하는 양상을 띄었고, 그 중 Cldn5와 JAM2에서 유의적인 증가를 보였다. 부위별로 나눠 유전자 발현을 분석한 결과, 차이를 나타내는 유전자도 있었다. Cldn5 mRNA의 발현은 전체적으로는 유의적으로 증가했으나 부정소 미부에서는 유의적으로 감소하였다. LPS투여군이 대조군보다 밀착결합 유전자 대부분에서 증가하는 양상을 나타내었고 일부는 유의적으로 증가하였다. 면역조직화학법으로 염색한 결과, Cldn1, 4, JAM3, Tricellulin의 경우 발색정도가 증가하였고, CAR의 경우 감소하였다. Biotin tracer를 통해 BTB의 투과성을 확인해본 결과, 대조군에서는 BTB에 막혀서 Sertoli cell 사이로 통과하지 못하였으나, LPS를 투여한 군에서는 BTB를 통과하여 감수분열 중인 정모세포 부근까지 확산되었다. 따라서 정소와 부정소에서 염증반응이 일어나게 되면 혈액정소장벽과 혈액부정 소장벽을 형성하는 밀착결합의 분자적 구조 변화를 초래하고, 이는 확산장벽의 변화시킴으로서 정자 형성과 성숙에 영향을 주어 남성 생식기능에 영향을 미칠 것으로 예측된다.

DEHP(di-ethylhexyl phthalate)는 가장 널리 쓰이는 플라스틱 가소제로서 인체노출 빈도가 매우 높은 내분비계장애물질이다. 본 연구는 임신기와 수유기 동안의 DEHP 노출이 후세대 생쥐 암컷 난소 및 난자에 미치는 영향을 알아보기 위한 목적으로 난소의 기능유전체 발현 변동을 조사하고, 유전자 발현 결과를 토대로 새로운 생식독성 마커를 발굴하고자 하였다. DEPH를 임신(GD) 1일째부터 수유기에 해당하는 출생 후(PND) 20일까지 모체에 0, 1.5 mg/kg/day 농도로 경구투를 한 후, F1 암컷의 난소 RNA를 추출하여 microarray 분석을 수행하였다. Expression Console software version1.1을 이용하여 발현변화가 나타난 유전자 정보를 획득하였다. 대조군과 1.5 mg/kg/day 처리군의 난소조직의 microarray 분석 결과, 약 120여 개의 유의적인 차이를 나타내는 유전자 정보를 확보하였으며, 특히 골지체에 존재하는 당전이효소인 fucosyltransferase 11(FUT11)이 유의적으로 증가함을 확인하였다. 난소 내 FUT11의 발현 양상을 확인하기 위하여 발정주기에 따른 난소 FUT11 발현, 과배란을 유도한 후 난포 성숙과정에서의 FUT11 mRNA 및 단백질 발현 변화를 분석하였다. 발정주기에 따른 난소 조직에서의 FUT11발현은 발정기시기에 가장 높았으며, granulosa luteal cell, oocyte, interstitium에서 FUT11 단백질 발현이 확인되었다. 과배란을 유도한 난소조직에서는 PMSG 46 h 째에서 FUT11의 발현이 가장 높았다. DEHP는 임신기 및 수유기를 통해 장기간 노출될 경우 후세대 암컷의 난소기능 및 난자에 기능적 문제를 야기한다. FUT11은 인체질병 발생시 비정상적인 당잔기의 합성에 관련이 있을 것으로 보고된 바 있다. 실제로 암 조직이나 염증부위의 단백질 및 당지질의 당쇄부위에 fucosylation이 증가한다. 본 연구 결과에서 DEHP의 장기 노출이 후세대 암컷 생쥐 난소내 FUT11 발현을 증가시켜 난소 내 granulosa luteal cell, interstitium, oocyte에서 생성되는 단백질의 당쇄구조의 비정상적인 fucosylation을 유발함으로서 난소의 내분비기능과 및 난자성장 및 성숙에 영향을 미칠 수 있을 것으로 사료된다.

남성의 체내에 미량의 estrogen이 존재하며, 정소와 부정소에 estrogen receptor(ERα, β)가 발현한다. Estrogen은 estrogen receptor를 통한 signaling을 통해 기능을 수행한다. 본 연구에서는 출생직후, 생후 1, 2, 4, 8주령의 생쥐 정소 및 부정소를 획득한 후 정량적 RT-PCR, Western blot, 면역조직화학법, image analysis를 통해 ERα의 발현을 분석하였다. 생쥐의 주령별 정소에서 ERα mRNA의 발현분석 결과, 정소에서는 신생부터 1주령까지 발현량이 급격히 증가하였으며, 4주령부터 약간 감소하였다. Western blot 결과, 출생 직후부터 생후 7일까지 급격히 증가하였고, 14일까지 높은 수준으로 발현하다가 이후 감소하였다. 면역조직화학법을 통한 ERα의 발현부위분석 결과, 정소에서 ERα 단백질은 주로 leydig cell과 peritubular cell에서 발현하였다. Image analysis를 통한 ERα 발현의 양적분석 결과, leydig cell에서 ERα는 출생 직후에 낮게 발현하다가 7일까지 급격히 증가하였고, 14일까지 높은 발현량을 유지하다가 이후 감소하였다. 이는 발생단계에 따른 남성호르몬 농도와 상반되는 결과로서, ERα의 발현이 leydig cell의 증식과 남성호르몬의 생성을 억제하는 것으로 추측할 수 있다. Peritubular cell에서 ERα는 출생 직후부터 생후 14일까지 꾸준히 증가하다가 이후에 급격히 감소하였다. ERα는 peritubular cell의 증식에도 관여하는 것으로 사료되며, 발생단계에서 leydig cell에 비해 peritubular cell의 증식이 먼저 완료되는 것으로 사료된다. 이를 종합하면, ERα는 정소에서 스테로이드형성 및 leydig cell/peritubular cell의 증식에 관여할 것으로 사료된다.

스피루리나 (Spirulina, Arthrospira platensis)는 미세조류에 속하는 섬사 형태의 시아노박테리아로서 오랜 기간에 걸쳐 식용으로 재배되어 공급되고 있으며, 최근 30여년 동안 스피루리나를 이용한 당뇨병과 같은 인간의 질병 개선효과에 대한 연구가 수행되고 있다. 스피루리나의 당뇨 개선 효과는 이미 알려져 있으나, 생식내분비계에서의 영향에 대한 연구는 거의 전무한 상황이다. 본 연구에서는 스피루리나의 섭취에 따른 당뇨 유발 동물 모델에서의 생식 내분비계 영향에 대하여 알아보고자 하였다. 6주령 SD rat 60마리를 대상으로 Streptozotosin (STZ) 50mg/kg을 1회 주사한 당뇨 유발 실험군과 4주간 스피루리나 200mg을 섭취한 실험군, STZ 주사 직 후 4주간 스피루리나를 섭취한 실험군, 2주간 스피루리나 섭취 후 STZ를 처리한 실험군, STZ 주사 후 2주 경과한 실험군을 확보하였다. 각각의 개체로부터 체중, 정소조직의 중량 변화 및 혈중 testosterone 농도를 분석하였으며, 정소 조직에서의 steroidogenesis 조절 유전자인 SF-1, StAR, 17β-HSD, 3β-HSD와 antioxidative pathway marker 유전자인 peroxiredoxin (Prdx) 4의 발현 변화를 realtime-PCR로 분석하였다. 정소조직 내의 Leydig cell의 변화 여부를 확인하기 위하여 Leydig cell의 세포수를 확인하였다. STZ 처리 후 스피루리나를 섭취한 실험군의 체중, 생식기관의 중량, 혈중 testosterone 농도 및 steroidogenesis 조절 유전자들의 발현이 STZ 단독 처리군보다 유의적으로 증가하였으며, 스피루리나를 2주간 먹인 후 STZ를 처리한 실험군에서 STZ를 단독 처리한 실험군보다 정소 무게가 유의적으로 증가하였다. Prdx 4의 발현이 스피루리나를 섭취한 STZ 처리군에서 STZ 단독 처리군에 비해 유의적으로 감소하였으며, Leydig cell 수가 스피루리나를 섭취한 실험군에서 증가하였다. 본 연구결과에서 스피루리나의 섭취가 제1형 당뇨로 인한 체중, 혈중스테로이드호르몬 농도 및 Leydig cell 감소를 완화하여 당뇨에 따른 남성생식기능의 저하를 예방하는 것으로 사료된다.

남성의 체내에 미량의 estrogen이 존재하며, 정소와 부정소에 estrogen receptor (ERα, β)가 발현한다. Estrogen은 ERα와 ERβ를 통해 세포의 생존, 증식 및 분화를 조절한다. ERα는 정소에서 스테로이드형성, 정자형성 부정소에서 정자 성숙 및 부정소 체액항상성 조절기능을 수행할 것으로 추측된다. 본 연구에서는 출생 직후, 생후 1, 2, 4, 8주령의 생쥐 정소 및 부정소를 획득한 후 정량적 RT-PCR, Western blot, 면역조직화학법을 이용하여 ERα의 발현을 확인하였다. 생쥐의 주령별 정소와 부정소에서 ERα mRNA의 발현분석 결과, 정소에서는 신생부터 1주령까지 발현량이 급격히 증가하였으며 4주령부터 약간 감소하였다. 부정소에서는 신생부터 4주령까지 비슷한 발현량을 보였으며, 8주령에서 발현량이 증가하였다. Western blot 결과, 8주령 부정소에서 efferent duct에서 가장 강하게 발현하였고, 부정소 체부에서 가장 적게 발현되었다. 면역조직화학법을 통한 ERα의 발현부위분석 결과, 정소에서 ERα 단백질은 주로 Leydig cell과 peritubular cell에서 발현하였다. 부정소에서는 efferent duct와 두부 부정소에서 가장 강하게 발현되었으며, 두부 부정소의 principal cell과 narrow cell에서 강하게 발현되었다. 체부 부정소에서는 basal cell과 clear cell에서 발현하였다. 미부부정소에서는 stromal cell에서 강하게 발현하였고, basal cell과 clear cell에서도 발현되었다. ERα는 정소에서 스테로이드형성 및 Leydig cell의 증식에 관여하며, 부정소에서 정자의 성숙 및 저장에 관여할 것으로 사료된다.