1966년 석사 과정에서부터 포유류에서 난자 성숙 과정이 어떻게 일어나는가 하는 것이 연구의 시작이었고, 80년 이후부터는 난자 성숙과 배 발생에 관련된 calcium 대사 연구를 하였다. 이 과정에서 자연히 세포 내로 Ca2+가 유입(Ca2+-influx)되는 요인을 밝혀야 했고, 그러다 보니 포유동물의 난자 성숙과 Ca2+-influx의 통로가 되는 Ca2+-channel을 연구하게 되었다. 1990년 후반부터는 포유동물의 난자 및 배에서 Ca2+-channel에 대한 연구를 주 테마로 하였다. 당시에는 이 분야의 논문이 그리 많지 않았으며, 따라서 세계 어느 연구실보다 이 분야에서 pioneer leader였다는 자부심을 가지고 2004년 8월 성진여자대학교 정년퇴임 시까지 연구하였다. 포유동물의 난자 성숙 과정에서 아미노산인 glutamine이 에너지원(energy source)로 쓰이며, protein 합성의 주 재료가 된다는 점을 밝혔는데, 이는 난자 성숙 과정에서 아미노산이 에너지 원으로 쓰이고 있음을 처음으로 밝힌 논문이었다(Bae and Foote, 1975). 이후 Batta와 Kundsen(1980), Burgoyne 등(1979)이 luteinizing hormone(LH) surge 후 cumulus cell enclosed 난자에서는 Ca2+ 농도의 급격한 증가가 일어나는 반면, folliclar fluid 내의 Ca2+ 농도가 감소하였음을 보인 연구 결과를 토대로 Bae(1981)과 Bae와 Channing(1985)에서 calcium on이 난자 성숙에 매우 중요한 역할을 한다는 것을 처음으로 보고하였다. 그 이전의 Tsafriri와 Bar-Ami(1978)과 Leibfried와 First(1979)는 Ca2+ion이 난자성숙과는 무관하다고 주장하였으나, 이는 실험 과정에서 배양액 내 Ca2+ 농도 계산이 잘못되었음을 증명하였다(Bae and Channing, 1985). 포유동물 난자를 체외에서 배양하면 자발적인 성숙(spontaneous maturation)이 일어나지만, 양서류나 불가사리는 progesterone이나 1-methyladenosine을 처리해야 난자 성숙이 일어난다. 그러나 포유동물의 난자라도 in vivo에서는 LH surge 후 난자 성숙이 시작된다는 점에서 보면 난자 성숙을 방해하는 무엇인가가 있을 것이라는 추정이 가능하고 난자 성숙 억제 물질(oocyte maturation inhibitor, OMI)을 찾아내는 것이 생식생리학 분야에서는 아주 커다란 문제로 부각되어 왔다. Tsafriri, Pomerantz와 Channing(1976)의 논문을 시작으로 많은 연구자들이 이를 연구하였고, 미국 내분비학회에서도 이들을 Gugenheim award를 수여하여 노벨의학상 수상 후보에 오를 것이라는 소문이 자자했다. 또한 미국 생식학회(SSR)에서는 제 1회 연구 논문상, Baltimore에서는 Great Baltimore Women Scientist로 선정되어 상을 받는 등 일약 전국적인 spot light를 받았다. 이 당시 본인 역시 OMI에 대해 이들과 달이 1975년부터 면역학적인 방법으로 접근하였으나, 연구 속도가 느려 1981년에 겨우 논문 하나를 발표하였다. Fast-moving protein과 slow-moving protein의 두 가지 다른 protein이 serum 내에는 없고 follicular fluid 내에 있으며, 생쥐 난자 성숙을 방해하고 있음을 밝혔다(Bae 등, 1981). 이보다 앞서 1979년 4월에 Dr. Channing 실험실에 합류하였는데 당시 Dr. Channing group이 발표한 OMI은 실험적 오류에 의해 생긴 결과였음을 밝혔고, 1980년 이후 Dr. Channing lab에서는 OMI에 대한 논문은 더 이상 발표되지 않았으며, Dr. Channing은 1985년에 암으로 세상을 떠났다. 포유류 배 착상 전 발생과정 중 일어나는 compaction 현상과 부화(hatching) 과정에서도 Ca2+가 필수적임을 보고하였다(Bae 등, 1994, 1996). 생쥐 난자 성숙과 포배기까지 배 발생에 Ca2+는 지대한 영향을 미치고 있지만 정작 Ca2+ion이 어떻게 난자나 배의 세포질 내로 들어 오느냐하는 Ca2+-channel에 대한 연구는 거의 없었다. 일반적으로 Ca2+-channel는 근육, 신경 조직 등에서는 많은 연구가 이루어졌지만, 포유동물의 난자 내 배에서의 연구는 거의 알려진 것이 없었다. 물론 근육이나 신경조직처럼 재료 구하기가 쉬우나, 포유동물의 난자와 배는 양적으로 재료를 구하기가 힘들다는 것도 원인 중에 하나이다. 예로 직경이 80um인 생쥐 난자 3,400개를 모아야 직경이 1.2mm인 개구리 난자의 체적이 되며, 3,400개의 난자를 모으려면 34명의 숙련된 technician이 생쥐 다섯 마리로 1시간이상 걸려 100개의 난자를 모아야 한다는 것이다. Okamoto 등(1977), Bae(1981), De Felici와 Siracusa(1982) 등이 포유동물 난자막에서 Ca2+-channel의 존재를 암시하였으나, Yoshida(1982)가 처음으로 방사성 동위원소 45Ca2+를 사용하여 Ca2+-channel의 존재를 확인하였으나, 어떤 type의 Ca2+-channel인지 밝히지는 못했다. 당시 한국에서는 45Ca2+를 사용하려면 방사능 취급 자격증을 갖고 있어야 하는 어려움으로 Ca2+-channel에 대한 연구를 시작하지 못하였다. 이후 Ca2+-channel에 대한 항체가 생산되자 본인은 항체를 이용한 면역학적 접근으로 생쥐 난자와 배에서 Ca2+-channel에 대한 연구를 시작하였다. 생쥐 난자 성숙 중에 일어나는 membrane potential이 변하는 것은 Na2+-channel을 통한 membrane potential 변화가 일어나는 것이 아니고 Ca2+-channel을 통해 Na2+의 이동이 일어나고, 이로 인해 membrane potential이 변하는 것임을 Yoshida(1983)이 증명하였다. 또한 Yoshida(1986), Peres(19987), 그리고 Blancato and Sayler(1990) 등 역시 Ca2+-channel의 존재를 증명하였으나, 어떤 type의 Ca2+-channel인지 밝히지는 못했다. 포유동물의 난자 및 배에서 Ca2+-channel를 밝힌 연구로는 Bae 등(1998, 1999a and b), Day 등(1998), Mattioli 등(1998), Emerson 등(2000) 등이 전부다. 이 중 Day 등(1998)은 생쥐 배에서 voltage dependent T-type Ca2+-channel을, Mattioli 등(1998)이 voltage dependent P/Q-type Ca2+-channel을, Emerson 등(2000)이 생쥐 2-세포배에서 voltage dependent L-type Ca2+-channel의 존재를 증명하였다. 본인은 Bae 등(1998, 1999a와 b)에서 생쥐 난자에 존재하는 P/Q-type, N-type, L-type의 voltage dependent Ca2+-channel이 존재함을 밝혔으며, Lee 등(2004)에서는 생쥐 난자 체외 성숙 중 성숙이 저해된 난자는 위의 네 가지 voltage dependent Ca2+-channel이 발현되고 있지 않으며, 이로 인해 난자 성숙이 일어나지 못한 것으로 보이며, 이는 생식 생리학의 난제 중 하나인 OMI의 원인 중 한 가지를 밝혀냈다는 점에서 큰 의의가 있다 하겠다.

생식력을 보존하고자 하는 가임기 여성 암환자는 항암치료 전, 자신의 난소를 동결보존할 수 있으 며, 암 치료 후 동결된 난소를 해동, 이식하는 방법으로 임신에 성공할 수 있다. 하지만 이 과정 중 난소과 난포는 동결 손상을 입게 되며, 난소 조직의 생존률은 크게 저하될 수 있다. 그 후 난소 이식 에 따른 허혈성 손상 등의 이유로 암 생존 후 동결 해동된 난소조직이 성공적으로 난소 기능을 유지 하는 것은 매우 어려운 일이다. 최근 난소의 동결과 보존 그리고 이식은 전세계적으로 활발한 연구 가 진행되고 있는 주제이지만 아직까지 획기적인 방법이 개발되지는 못하였다. 따라서 가임력 보존 의 가장 궁극적인 방법인 난소동결보존을 최적화하여 그 효율성을 높이고, 이식후 생존기간을 연장 시킬 수 있는 기술의 탐색이 지속적으로 이루어져야 할 것이다.

Foodfish species에서 어류의 성장과 관련이 있는 체중과 전장은 경제적으로 중요한 형질이다. 어류의 성장에 관여하는 유전자를 확보하기 위하여 동일한 사육환경에서 체중이 2배 이상 차이를 나타낸 강도다리를 선별하여 유전자 발현양상을 조사하였다. 강도다리의 체중을 기준으로 large 그룹과 small 그룹으로 나누었으며, ACP(annealing control primer) system을 이용하여 근육조직에서 발현량 차이를 나타내는 차등발현유전자 5개를 얻었다. 5개의 차등발현유전자 중 1개는 creatin kinase muscle type(CKM1)에 해당하는 유전자 단편이었고, 4개는 unknown gene이었다. CKM1 유전자는 성장이 빠른 강도다리 그룹에서 발현량이 4.15배 많았으며, 전체유전자(genomic structure)는 8개의 exon과 7개의 intron으로 이루어져 있었다. CKM1 유전자는 근육조직을 비롯하여 신장, 아가미, 지느러미와 혈액에서는 발현되었으나, 간 조직에서는 발현되지 않았다.

Neural precursor cells (NPCs) with abilities to self-renew and differentiate into neurons are born in the subventricular zone of the hippocampus and the subgranular zone in the adult mammalian brain. NPCs maintain their population by symmetric cell division and neuronal cell differentiation started by asymmetric cell division. Asymmetric cell division produces two daughter cells with different cellular fates. It has been shown that multiple transcription factors, like homeodomain transcription factors and basic helix loop helix (bHLH) transcription factors, play cruel role in cell fate determination (Bertrand et al., 2002). Multipotent cortical progenitors are maintained in a proliferative state by bHLH factors including Id and Hes families. The transition from proliferation to neurogenesis involves a coordinate increase in the activity of proneural bHLH factors (Mash1, Neurogenin1, and Neurogenin2). As development proceeds, inhibition of proneural bHLH factors in cortical progenitors promotes the formation of astrocytes. Finally, the formation of oligodendrocytes is triggered by an increase in the activity of bHLH factors Olig1 and Olig2 that may be coupled with a decrease in Id activity. Thus, bHLH factors have key roles in corticogenesis, affecting the timing of differentiation and the specification of cell fate. Hes1 is a vertebrate homologue of the Drosophila bHLH protein Hairy, originally known as a transcriptional repressor that negatively regulates neuronal differentiation. Hes1 expression in neuronal precursors precedes and represses the expression of the neuronal commitment gene Mash1, a bHLH activator homologus to the proneuronal Achaete-Scute genes in Drosophila (Campuzano and Modolell, 1992). Down regulation of Hes1 expression in developing neuroblasts may be necessary for the induction of a regulatory cascade of bHLH activator proteins that controls the commitment and progression of neural differentiation. Expression of Hes1 inhibited neurite outgrowth, whereas Mash1 expression increased neurite outgrowth. Mash1 can induce bipolar neuron differentiation (Tomita et al., 1996) and NSCs culture obtained from Mash1-/- mice cannot differentiate into GBAergic neurons (Oishi et al., 2009) Hes1 is an essential effector for Notch signaling, which regulates the maintenance of undifferentiated cells (Artavanis-Tsakonas et al., 1999). In contrast, it is previously reported that platelet-derived growth factor induces the expression of Mash1 mRNA by regulating the phosphorylation of Hes1 and TLE1 (Ju et al., 2004). Hes1 is required for neuronal differentiation in PDGF treated NSC cultures. The major cell types in the cerebral cortex and hippocampus are the glutamatergic neurons and the GABAergic neurons. Cholinergic neurons are important in spatial learning and memory formation and depleted in patient’s brain of early Alzheimer’s disease. It has not been clear, however, whether new born adult NPCs could generate different cell types of neurons with distinct cellular and physiological properties. During the development, glutamatergic neurons consisting of radially migrating neurons are originated from the ventricular zone of the dorsal telenchephalon (pallium) and give rise to pyramidal neurons. Glutamate and glutamate receptors are involved in cognitive functions by forming major excitatory network. GABAergic neurons in the neocortex and hippocampus are in part migrated from the ventral telenchephalon or from the dorsal NPCs and function as local interneurons by forming inhibitory networks which regulate large populations of glutamatergic pyramidal neurons. During the development, spatiotemporal gene expression regulated by extracellular signaling factors is believed to determine the formation of neuronal phenotypes. Platelet derived growth factor B is known to induce the differentiation into neurons rather than glial cells in the rat NPCs. We found that platelet derived growth factor B is expressed in dorsal cortex and hippocampus more than in ventral cortex in the period of pyramidal cell differentiation of the embryonic rat brain. It indeed induces cell type specific differentiation into glutamatergic cells that produce the glutamate transpoter, vGluT1 and glutamate at the late stage of differentiation although it promotes neuronal differentiation at the early stage in NPCs primarily cultured from the rat embryonic hippocampus. Brain-derived neurotrophic factor, however, facilitated GABAergic differentiation in the hippocampal NPCs that generate glutamatergic pyramidal cells in a similar manner. We also found many transcriptional factors such as homeobox genes (Dlx1, Nkx2.1, Pax6) and bHLH genes (NeuroD, Ngn1, Hes1) are involved in cell type specific differentiation into glutamatergic, GABAergic, and cholinergic cells. We observed the expression of Pax6, homeodomain transcription factor, and Hes1, bHLH transcription factor, increased during PDGF-induced early differentiation in neural stem cells. These transcription factors, however, are also expressed in differentiated neurons with specific phenotype at late differentiation stage. We found pax6 is expressed in cholinergic neurons in the adult brains and in cultures. Phosphorylation of neurogenic transcription factors by protein kinases has been reported as predominant strategy in gene regulation during neuronal development and these regulated activities of different transcription factors are known to be involved in cell fate determination. Homeodomaininteracting protein kinases2 (HIPK2) which belongs to HIPK family has been identified as a nuclear serine-threonine kinase and is known to interact with several transcription factors to regulate gene transcriptions. Among several transcription factors, HIPK2 is mainly reported to target the homeodomain transcription factors such as Nkx and Pax6. Considering the importance of homeodomain transcription factors in neurogenesis and differentiation, HIPK2 also seem to play critical roles in those transcriptional regulations during embryogenesis. To define the roles of HIPK2 in neuronal differentiation during embryonic development, we investigated the expression patterns of neurogenic transcription factors such as Pax6, Hes1 and Mash1 in HIPK2 overexpressing NSCs. Hes1 showed different expression patterns between the wild type and mutant HIPK2 overexpressed cells and Mash1, which is reported to be repressed by Hes1, also showed altered expression patterns. We detected the mRNA expression of Hes1 is upregulated by HIPK2 during neuronal differentiation. The overexpressed Pax6 induced differentiation of neural stem cells into cholinergic neurons and suppressed differentiation into GABAnergic neuron both in vitro and in vivo transplantation study. To evaluate the effect of Pax6 on the transcriptional activation of Hes1 promoter, we performed luciferase reporter assay in NIH3T3 cells. Reporter expression of Hes1 promoter was enhanced upon stimulation with wild type Pax6 and wild type HIPK2. Furthermore, the HDAC inhibition mediated by TSA(Trichostatin A) has been shown to repress the reporter expression. The treatment of TSA increased neurofilaments and GAD expression in E14.5 cortical neuronal cell. These findings suggest that Pax6 promotes neuronal subtype differentiation via regulation of Hes1 bHLH transcription factor, which is mediated by HDAC. To examine the effect of Pax6 and HIPK2 on the transcriptional activation of Hes1, efficiency of hes1 promoter was measured by a luciferase reporter assay. When DNA constructs encoding Pax6 and HIPK2 were transfected along with Hes1 promoter, the expression of the reporter was highly increased. Furthermore, the HDAC inhibition mediated by TSA(Trichostatin A) repressed the reporter expression. Interaction of Pax6 and HIPK2 was shown by co-immunoprecipitation and binding of Pax6 to hes1 promoter was detected by chromatin immunoprecipitation. I also found overexpression of HIPK2 and Pax6 facilitated neural stem cells to differentiate into cholinergic cell fate in NSCs primarily cultured from the rat hippocampus. This is also supported by analysis of the brains of sey/neu Pax6 mutant mice and HIPK2 knock out mice. These findings suggest that Pax6 activation by HIPK2 promotes neuronal subtype differentiation via up regulation of Hes1 and down regulation of Mash1 and it is mediated by HDAC.

남성의 체내에 미량의 estrogen이 존재하며, 정소와 부정소에 estrogen receptor(ERα, β)가 발현한다. Estrogen은 estrogen receptor를 통한 signaling을 통해 기능을 수행한다. 본 연구에서는 출생직후, 생후 1, 2, 4, 8주령의 생쥐 정소 및 부정소를 획득한 후 정량적 RT-PCR, Western blot, 면역조직화학법, image analysis를 통해 ERα의 발현을 분석하였다. 생쥐의 주령별 정소에서 ERα mRNA의 발현분석 결과, 정소에서는 신생부터 1주령까지 발현량이 급격히 증가하였으며, 4주령부터 약간 감소하였다. Western blot 결과, 출생 직후부터 생후 7일까지 급격히 증가하였고, 14일까지 높은 수준으로 발현하다가 이후 감소하였다. 면역조직화학법을 통한 ERα의 발현부위분석 결과, 정소에서 ERα 단백질은 주로 leydig cell과 peritubular cell에서 발현하였다. Image analysis를 통한 ERα 발현의 양적분석 결과, leydig cell에서 ERα는 출생 직후에 낮게 발현하다가 7일까지 급격히 증가하였고, 14일까지 높은 발현량을 유지하다가 이후 감소하였다. 이는 발생단계에 따른 남성호르몬 농도와 상반되는 결과로서, ERα의 발현이 leydig cell의 증식과 남성호르몬의 생성을 억제하는 것으로 추측할 수 있다. Peritubular cell에서 ERα는 출생 직후부터 생후 14일까지 꾸준히 증가하다가 이후에 급격히 감소하였다. ERα는 peritubular cell의 증식에도 관여하는 것으로 사료되며, 발생단계에서 leydig cell에 비해 peritubular cell의 증식이 먼저 완료되는 것으로 사료된다. 이를 종합하면, ERα는 정소에서 스테로이드형성 및 leydig cell/peritubular cell의 증식에 관여할 것으로 사료된다.

Human embryonic stem cells (hESCs) are promising cell source because of their unique self-renewal and pluripotency. Although hESC-derived cardiac cells are currently generated worldwide, cryopreservation of these cells is still limited due to low rate of post-thaw survival. Cryopreservation of hESC-derived cardiac cells is critical in that their long-term storage can accelerate their use in regenerative medicine. However, to date, there are few reports on efficient cryopreservation and post-thaw survival of hESC-derived cardiac cells. In this study, we evaluated the effects of ginsenoside, which is known to improve survival of rat embryonic cardiomyocytes against myocardial ischemia injury in diabetic rats (Wu et al., 2011), on the survival of hESC-derived cardiac cells after thawing. We induced differentiation into cardiac cells using our previously reported method (Kim et al., 2011). Differentiated, pre-beating stage cardiac cells were cryopreserved using either mass cryopreservation or vitrification. To evaluate the effects of ginsenoside (Re, Rb), we compared three sets: pre- and post-thaw treatment, pre- or post-thaw treatment only. The survival of post-thaw cardiac cells were evaluated using Trypan-blue and Annexin V staining. In addition, the three groups were treated with ROCK inhibitor Y-27632, and compared with non-treatment groups. The effect of ginsenoside was significant in post-thaw treatment group, i.e, thawed cells expressed cardiac specific genes and showed specific functionality such as spontaneous beating. Taken together, we demonstrated favorable effects of ginsenoside on the survival of hESC-derived cardiac cells after cryopreservation and thawing. These results suggest a possible application of well-known cardioprotectant ginsenoside in cell-based tissue engineering using hESC-derived cardiac cells.

DEHP(di-ethylhexyl phthalate)는 가장 널리 쓰이는 플라스틱 가소제로서 인체노출 빈도가 매우 높은 내분비계장애물질이다. 본 연구는 임신기와 수유기 동안의 DEHP 노출이 후세대 생쥐 암컷 난소 및 난자에 미치는 영향을 알아보기 위한 목적으로 난소의 기능유전체 발현 변동을 조사하고, 유전자 발현 결과를 토대로 새로운 생식독성 마커를 발굴하고자 하였다. DEPH를 임신(GD) 1일째부터 수유기에 해당하는 출생 후(PND) 20일까지 모체에 0, 1.5 mg/kg/day 농도로 경구투를 한 후, F1 암컷의 난소 RNA를 추출하여 microarray 분석을 수행하였다. Expression Console software version1.1을 이용하여 발현변화가 나타난 유전자 정보를 획득하였다. 대조군과 1.5 mg/kg/day 처리군의 난소조직의 microarray 분석 결과, 약 120여 개의 유의적인 차이를 나타내는 유전자 정보를 확보하였으며, 특히 골지체에 존재하는 당전이효소인 fucosyltransferase 11(FUT11)이 유의적으로 증가함을 확인하였다. 난소 내 FUT11의 발현 양상을 확인하기 위하여 발정주기에 따른 난소 FUT11 발현, 과배란을 유도한 후 난포 성숙과정에서의 FUT11 mRNA 및 단백질 발현 변화를 분석하였다. 발정주기에 따른 난소 조직에서의 FUT11발현은 발정기시기에 가장 높았으며, granulosa luteal cell, oocyte, interstitium에서 FUT11 단백질 발현이 확인되었다. 과배란을 유도한 난소조직에서는 PMSG 46 h 째에서 FUT11의 발현이 가장 높았다. DEHP는 임신기 및 수유기를 통해 장기간 노출될 경우 후세대 암컷의 난소기능 및 난자에 기능적 문제를 야기한다. FUT11은 인체질병 발생시 비정상적인 당잔기의 합성에 관련이 있을 것으로 보고된 바 있다. 실제로 암 조직이나 염증부위의 단백질 및 당지질의 당쇄부위에 fucosylation이 증가한다. 본 연구 결과에서 DEHP의 장기 노출이 후세대 암컷 생쥐 난소내 FUT11 발현을 증가시켜 난소 내 granulosa luteal cell, interstitium, oocyte에서 생성되는 단백질의 당쇄구조의 비정상적인 fucosylation을 유발함으로서 난소의 내분비기능과 및 난자성장 및 성숙에 영향을 미칠 수 있을 것으로 사료된다.