오늘날 생명과학의 발달은 인류에게 영원한 번영과 행복을 가져다 줄 열쇠로 믿고 있다. 그러나 우리나라의 생명과학 특히 최근의 첨단생명과학의 현실을 보면 너무나 일천한 역사를 가지고 있음을 인정하지 않을 수 없으며, 다른 한편으로는 짧은 역사 속에 이룩한 업적이 자랑스럽게도 생각된다. 오늘날 과학문명의 이기를 비롯한 인류의 모든 선진문화의 혜택은 이념의 변화와 경제성장에 그 기초를 두고 있음을 우리는 잘 알고 있다. 여기에서 나는 해방 전 우리 민족이 세계적인 최빈국(貧國)일 때 초등학교를 다녔고, 8.15해방과 6.25전쟁, 4.19학생운동과 5.16군사혁명을 거치는 동안 대학을 나와 2002년 65세의 나이로 대학 강단을 떠날 때까지 40여 년간 우리나라 대학교육의 한 가닥을 잡고 씨름하며, 다른 한편으로는 생명과학의 연구란 틀 속에서 맴돌았던 꿈만 같았던 지난날을 정년 후 9년이 지난 오늘에 와서 잠시 되돌아보는 시간을 가지게 되었다. 유년시절의 꿈과 60년대(GNP 79불) 선배들의 명에 순종하여 강의하고, 손에 잡히는 대로 실험하고 논문을 써 댔으며, 70년대(GNP 255불)에 와서 주어진 자연의 생명현상을 계수화 하거나 인위적으로 변형시켜 계수화 하는 논문을 작성하던 때를 지나, 80년대(GNP 1,000불)에 들어서 선진연구방법을 모방 응용하는 연구와 논문을 작성하였다. 90년대 이 후 6,000불을 넘어서면서 오늘날과 같은 첨단기기의 설치와 기법의 도입으로 연구를 시작했으나, 2002년(GNP 12,100불) 이미 65세 정년퇴임의 자리가 기다리고 있었다. 앞으로 우리 교실의 연구방향은 방명걸 교수팀의 “정자의 수정에 관련된 연구”와 류범용 교수팀의 “정원줄기세포에 관련된 연구”가 뒤를 이어갈 것이다. 교육의 수레바퀴는 구르기 시작한 후 멈추지 않고 오직 앞만을 향해 굴러가고, 과학의 발달은 내리막 경사의 레일 위를 달리는 제동장치 없는 기관차와 같이 영원히 구르고 달려갈 것이다. 이제 20,000불 시대를 눈앞에 두고 있는 후학들에게, 잠시나마 참담했던 나의 과거와 뒤늦게 정신을 차린 현재, 그리고 미래를 엮어 여러분과 함께 부담 없는 회고의 시간을 가지고자 하였습니다. 인간의 행복을 가져다 줄 생명과학을 비롯한 과학문명의 발달은 사회안정과 경제성장에 비례하는 것으로 사료된다. 저는 이 시간이 제 일생에 가장 뜻있고 행복한 시간으로 기록될 것입니다.

Since the first case of pregnancy by in vitro matured oocyte was reported (Cha et al., 1991), in vitro maturation (IVM) could be used as an alternative choice for the treatment of infertile women with polycystic ovary syndrome (PCOS) and poor responders to ovarian stimulation and as one of the strategies for fertility preservation (Chian, 2004). Immature oocyte retrieval followed by IVM is a promising potential treatment option, especially for women who are infertile through PCOS. Although the pregnancy and implantation rates of IVM treatment are not as high as conventional IVF treatment, IVM treatment has many advantages for infertile women with PCOS, because this group of patients is extremely sensitive to stimulation with exogenous gonadotropins and is at increased risk of developing ovarian hyperstimulation syndrome (OHSS). Different protocols have been used before immature oocyte retrieval, indicating that there are beneficial effects with FSH or LH priming on oocyte maturation. To date, the clinical pregnancy and implantation rates obtained from IVM treatment in infertile women with PCOS are approximately 30-35% and 10-15% respectively (Chian, 2004). The clinical outcome has substantially improved in recent years with pregnancy rates between 20 and 54% and the postnatal follow-up studies of the children have been reassuring (Suikkari, 2008). Currently, more than 400 healthy infants have been reported with IVM method (Jurema and Nogueira, 2006; Suikkari, 2008). Although good results have been reported by some clinics, IVM has not yet become a mainstream fertility treatment. The most important reason for this is the lower chance of a live birth per treatment compared with conventional IVF. Despite its clinical success, there has been little information about the suitable conditions for human IVM. Therefore, improving developmental competency of immature oocytes continues to be an important concern of most IVM centers. Among many factors which affect efficacy of IVM, culture conditions are believed to be the most important factor, because different culture medium with changes of constituents can affect the oocyte maturation potential and subsequent embryonic development (Trounson et al., 2001). Currently, many different types of commercially available maturation media have been used in clinical IVM. They are commonly supplemented with hormone (recombinant FSH, hCG) and protein sources. Protein component may serve as a nitrogen source and act as a chelator of toxic metal ions and an antioxidant within culture media. In this respect, a development of well defined maturation medium supplemented with an efficient and safe protein source would improve IVM results. We previously reported that developmental competency of immature oocytes (either GV or MI) obtained from stimulated IVF cycles was comparable when matured in vitro with commercial G2 media supplemented by either human follicular fluids (hFF) or human serum albumin (HSA) (Jee et al., 2008). Our results suggest that hFF as a protein supplement for human in vitro maturation can be replaced by highly defined HSA. A development of well defined maturation medium should be continued in the effort to improve IVM results. More research is also needed to determine the roles of specific components and optimal culture conditions required in maturing oocytes. IVM of human oocytes retrieved from antral ovarian follicles is an emerging procedure quickly being incorporated into the realm of assisted reproductive technologies (ART). This new technology has several potential advantages over traditional controlled ovarian hyperstimulation for IVF, such as reduction of costs by minimizing gonadotropin and GnRH analogue use, elimination of OHSS, and simplicity of protocol. IVM of oocytes for ART in human beings still is undergoing refinement but currently is providing efficacy and safety outcome comparable to that of traditional IVF in recent selected studies. Implementing IVM into an established IVF practice is feasible and requires only a few simple adjustments. Crucial to the advancement and optimization of the technology is a better understanding of how to maximize immature oocyte developmental competence and endometrial receptivity.

난자 및 정자형성과정은 성에 따라 차이가 일부 있지만 생식줄기세포 (germ-line stem cells)의 증식을 통해 그 수를 유지하고, 그 중 일부 또는 전부가 감수분열에 진입하여 생식세포인 정자와 난자를 생산한다. 따라서 생식세포의 형성과정은 세포의 증식과 성장, 분화 기작을 연구할 수 있는 매우 훌륭한 시스템으로 여겨져 과거로부터 많은 연구가 진행되어왔다. 더욱이 인간에서 보조생식술과 동물 생명공학의 발전을 통해 그 중요성은 더욱 커지고 있으나, 그 체외배양 모델시스템이 없어 최근까지의 연구에는 많은 어려움이 있었다. 과거에 많은 연구자들에 의해 생식세포의 배양, 정소와 난소의 기관 배양 등이 시도된 바 있으나, 대부분 단기간 내 성공일 뿐 장기간 배양에는 어려움이 있었다. 하지만 교토대학의 Shinohara 교수팀에 의해 체외에서 정원줄기세포의 장기간 증식 배양법이 확립되었고, 또 배양된 정원줄기세포가 정소 세정관 내에 이식을 통해 정자형성과정을 재현할 수 있음이 확인되어 이 분야의 연구와 응용연구는 활성화되기 시작했다. 또한, 최근 들어 배아줄기세포, 성체줄기세포와 같은 여러 종류의 전분화능 줄기세포에서 생식줄기세포 또는 생식세포로의 분화가 일부 성공됨에 따라 생식세포의 증식과 분화의 조절기작이 일부 밝혀지고 있다. 따라서 이러한 연구성과 는 현재까지 치료가 불가능한 비폐쇄성 무정자증환자의 불임치료 방법으로의 발전 가능성을 제시할 뿐 아니라 동물생명공학분야로의 응용가능성을 더욱 높여주고 있다. 본 연제에서는 실험동물과 인간의 줄기세포로부터 생식세포의 분화에 관한 최근 연구를 정리하고, 이를 이용한 기초연구, 산업, 임상치료에의 적용가능성을 제시하고자 한다.

The zebrafish (Danio rerio) is a vertebrate model system suitable for fishing novel genes in post-genome era. Two neural mutants isolated from the ENU-based chemical mutagenesis, were characterized and the point mutations were identified by the positional cloning method. The first mutant is headless: Wnt antagonists secreted by the organizer have been identified as head inducers. The severe head defects in headless are due to a mutation in Tcf-3, a component of the Wnt pathway. The second is mind bomb: Reduced lateral inhibition in mutant permits too many neural progenitors to differentiate as neurons. Mind bomb encodes a novel gene in the Notch signaling pathway. In addition to chemical mutagenesis, we developed a novel transgene reporter system and tried to apply its use for the insertional mutagenesis. The first mutant "ondal" from this new screening approach, was characterized and mapped to a gene involved in axonal myelination and human schizophrenia. The other mutants, samdori and hayan-4 are being mapped and characterized. As a separate approach, we are challenging a genome-wide screen against the human UniGene collections. Currently, more than 15,000 human full-length cDNAs are available from the Korean UniGene Information (KUGI). After in silico screening of functionally unknown genes through database search, we performed overexpression experiments by microinjecting the single human genes into the zebrafish embryos. So far, we performed microinjections more than 2,700 human full-length cDNAs and identified 50 functionally active genes. Zebrafish embryos display variable phenotypes from developmental defects to neuronal cell death in injected embryos. Many of these genes were involved in not only developmental process but also diseases, such as cancer. After these phenotype-based screening, homologous zebrafish genes were cloned and further functional studies were performed by expression analysis, overexpression and antisense knockdown approaches. From these functionally active genes, we found that the human clone #462, now named it as "Ottogi", plays a role in vertebrate head formation during early development. Overexpression of Ottogi caused a big head phenotype, indicating its possible role in the Wnt signaling pathway. Ottogi physically interacted with the Wnt receptor Frizzled 8 within the endoplasmic reticulum. These findings suggest that Ottogi is a novel component negatively regulating the Wnt signal pathway. In addition, the human clone #498, now named as ZNF312b, plays a role in tumor progression and metastasis in gastric cancer via transcriptional activation of the K-ras oncogene. ZNF312b seems to be specifically overexpressed in gastric cancer tissues and cell lines. The overexpression of ZNF312b induces cancer-like phenotypes, including accelerated proliferation and increased tumor masses in nude mice, which are reversed by its knockdown in gastric cancer cell lines, implying involvement in gastric tumor progression.

형질전환 동물은 질병의 모델, 유전자 기능 및 조절에 관한 연구, 또는 독성물질을 탐색하는 연구 수단 등과 같은 기초 연구 분야뿐만 아니라 인체에 유용한 단백질의약품의 생산과 간, 신장 등 특정 장기의 공급원 등과 같은 임상적인 분야에서도 활용가치가 매우 크다. 이 중 형질전환 동물을 이용한 치료용 단백질의 생산은 비교적 낮은 생산 원가와, 분리와 정제의 용이성, 그리고 효율적인 대량 생산 체계의 확립 등의 장점을 가진다. 형질전환동물을 바이오의약품 생산수단으로 사용하고자 하는 발명에는 젖, 소변 또는 혈액을 통하여 백혈구증식인자, 조혈인자, 항체 등 고가의 생물의 약품을 배출시키는 소, 돼지, 흑염소 등이 등록되어 있다. 이 방법은 기존의 세포배양 방법보다 생산비용이 훨씬 저렴하고 부가가치도 높아 새로운 의약품 생산수단으로 주목받고 있다. 그러나 현재까지 방대한 시간과 비용이 투자되었음에도 불구하고 형질전환 가축을 이용한 바이오 의약품의 경제적인 성공사례는 매우 미미하며, 그 근본 원인은 대부분 포유류들의 긴 세대 간격, 천문학적인 비용과 많은 시간, 그리고 외래 단백질이 체내에서 과잉 발현됨으로 인해 발생하는 형질전환동물의 생리적인 부작용에 있다고 요약할 수 있다. 생체반응기로서 가금이 포유동물에 비해 갖는 장점은 첫째, 성성숙기간과 세대간격이 짧으며, 둘째, 포유류에 비해 번식능력이 대단히 높기 때문에(연간 300개 이상의 계란을 생산) 형질전환된 가금의 계통성립이 용이하고, 셋째, 비교적 적은 노력과 비용으로 많은 개체를 대상으로 하는 실험이 가능하다는데 있다. 또한 각 계란의 난백에는 총 3 g 정도의 단백질 성분이 있으며 단백질의 종류는 8가지 뿐이다. 따라서 형질전환 포유동물의 젖에 비하여 형질전환 닭의 계란에 함유된 재조합 단백질을 분리 및 정제하는 것이 훨씬 용이하다. 예를 들면, 현재 난백으로부터 특정 단백질을 분리하는 비용이 g당 10달러 정도로 추산되는데, 이는 세포배양액으로부터 특정 단백질을 분리하는 비용의 1%에 불과하다. 따라서 형질전환 닭의 생산은 기초적인 연구로서도 중요할 뿐만 아니라 계란을 이용한 치료용 단백질의 대량 생산에 있어서도 그 의미가 크다. 닭은 번식생리학적으로 포유동물과 매우 달라 기존의 포유동물 형질전환 방법을 동일하게 적용할 수는 없으며, 형태적, 발생학적 차이점을 고려하여 발전된 형질전환 닭의 생산방법에는 유전자를 전달받는 표적세포와 유전자전이 방법에 따라 다양한 방법이 이용되고 있다. 형질전환 닭의 생산을 위한 표적세포로는 stage X의 배반엽세포(갓 산란된 유정란의 배를 구성하는 세포), 원시생식세포(primordial germ cell), 닭의 난관에서 채집한 1세포기의 수정란 그리고 정자 등이 있다. 표적세포에 대한 유전자 전이 방법에는 물리화학적 DNA 전이 방법과 retrovirus (lentivirus) vector system을 이용한 방법으로 크게 나눌 수 있다. 각각의 방법은 외래 유전자의 전이 효율이나 다음 세대로의 전달 여부, 그리고 기술적인 용이성에서 조금씩의 차이를 나타내는데, 이 중 다음 세대로의 유전자 전달이 잘 이루어지고 기술적인 용이성이 높은 관계로 현재 가장 널리 사용되고 있는 방법은 배반엽세포 및 원시생식세포를 표적세포로 virus vector system을 이용하여 유전자를 전이하는 방법이다. 기존의 다른 유전자 전이 체계와 비교해 볼 때, 레트로바이러스를 이용한 유전자 전이는 기술적인 용이성과 효율적인 발현, 그리고 전달된 유전자의 유전적인 안정성 등의 장점을 나타낸다. 기존의 retrovirus vector에서는 주로 LTR이나 β-actin, CMV promoter 등과 같은 constitutive promoter를 이용한 외래 유전자의 발현은 개체 전체에 걸쳐 광범위하게 이루어지므로 형질전환 동물의 생리적인 부작용을 나타내는 경우가 많았다. 이러한 문제점을 해결하기 위해서 외래 유전자의 발현으로 인한 생리적인 부작용을 최소화하면서 또한 특정 조직에 국한하여 일어날 수 있도록 조직 특이적 발현 promoter와 유전자의 발현을 인위적으로 조절할 수 있는 promoter 등을 개발하기 위한 노력이 시급한 실정이다. 예를 들면, 닭의 난관에서 특이적으로 발현하는 ovalbumin promoter와 tetracycline inducible promoter 등이 그것이다. 또한, 필요한 경우에는 동물체에 도입된 외래 유전자의 발현을 최대화하기 위하여 WPRE (woodchuck hepatitis virus posttranscriptional regulatory element)와 같은 서열도 도입되어야 할 것이다. 본 연구자들은 retrovirus vector system을 이용하여 닭의 배반엽세포에 외래유전자를 전이하는 방법으로 형질전환 닭을 생산하는 연구를 진행하고 있으며, 선행된 연구 결과에 의하면 전이된 외부 유전자가 닭의 genome 상에 삽입되어 발현되는 것을 생산된 모든 병아리에서 확인할 수 있었다. 따라서 생체반응기로서 일반 포유류가축 대신 닭을 사용하는 것이 앞에서 언급한 시간적, 경제적 장점 외에 형질전환개체의 생산 측면에서의 성공 가능성이 훨씬 높다고 단언할 수 있다. 본 연구자는 외래 유전자의 발현율을 증가시키기 위하여 retrovirus vector에 WPRE 서열을 도입하였으며, 외래 유전자의 과잉 발현에 의한 개체의 생리적인 부작용을 최소화하기 위하여 외래 유전자의 발현에 대한 개시 및 종료가 조절 가능한 tetracycline inducible expression system을 도입하여 형질전환 닭을 생산하였다. 현재까지 형질전환 닭으로부터 발현을 시도한 재조합 단백질로는 단일클론항체, FSH, EPO, G-CSF 그리고 interferon 등이 있으며, 이들 단백질이 산란된 계란의 흰자에 분비되도록 하는 기술을 개발하여 실용화하려는 시도를 하고 있다. 그러나 현재까지 개발된 형질전환 닭의 생산에 있어서 매우 만족할 만한 성공적인 사례는 거의 전무한 실정이며, 이에 생체반응기로서의 형질전환 닭의 생산에 관한 연구가 적극적으로 진행되어야 할 것으로 생각된다.

This study is to survey the ultrastructure of gamete cells and micropyle of pre-fertilized and post-fertilized eggs after HCG hormone treatment by transmission and scanning electron microscopy (TEM and SEM) in E. akaara, E. bruneus and E. septemfasciatus. These fishes are economical importance species for Jeju coastal area resources. In spite of its an importance resources, details studies on the ultrastructural aspects of gamete cells for its reproductive biology have not been undertaken. Morphological features of ovulation process have been studied during its normal occurrence in the reproductive cycle of these fish by light microscopy. Moreover, it has been studied for many years to induce spawning by environmental factors (day length, water temperature etc) or injection of HCG for ovulation in these species. Studies on the micropyle was mainly focused on the eggs of insects, fresh water and a few sea water fishes. Micropylar structure of fish displays morphological characteristics of interspecies-specific by inhabitant environment and spawning feature. On the other hand, it is an importance cue for a taxonomical indicator and identification fish eggs. SEM studies were performed on growing and mature oocytes obtained by stripping and cannulation from 3 grouper species sampled between July and August in spawning season. The outer layer of chorion of preovulatory growing stage oocytes could be divided into four layers; zona pellucida, follicular cell layers consisted of granulosa and thecal cells layer and the most outer ovigerous lamella. Ovulation process of mature stage oocytes initiated by rupture of ovigerous lamella and ovulated by contraction of follicular cell layers. Besides, the micropylar shape of ripe stage oocytes in E. akaara, E. bruneus and E. septemfasciatus presented volcano or crateriform-like cylindrical form. Internal structure of micropylar vestibule displayed cylindrical clockwise 8 or 10 spiral arrangement structure in these species. The micropyle diameter and apparatus at the animal pole differ significantly among the 3 species. The difference in their diameters suggests species-specific in the correlation between spermatozoal head size and micropylar diameter for polyspermy prevention and hybridization during fertilization. Besides, after artificial fertilization, the vestibule morphologically transformed into dom-shape and pillar-shape for fertilization cone formation. Pores of various sizes in the 3 grouper species were somewhat regularly distributed in concentric circles only around the micropyle. In particular, large pores had numerous gill filament-shaped projections connected to oolemma. These structures are suggested to be related to gas exchange, osmoregulation, and micronutrient influx or efflux between eggs and water during fertilization and egg development. In addition, spermatozoa ultrastructure was examined in 3 grouper species. TEM investigation revealed that, in all species, spermatozoa display a round head, a nucleus containing highly condensed, filamentous chromatin clusters, no acrosome, a short midpieces consisting of numerous mitochondria and the proximal and distal centrioles and a flagellum exhibiting the typical axoneme structure (9+2). Especial, both E. akaara and E. bruneus display regular laternal fins in flagella, but in E. septemfasciatus, no fins in flagella with hook shape tails.

이 두 그룹(two culture, 인문 문화와 과학 문화)에 속하는 사람들은 지식 수준이 비슷하고 같은 인종이고, 출신성분도 크게 다를 바 없고, 거의 같은 수입을 가지면서도 교양, 도덕, 심리적인 경향에 있어서 거의 공통점이 없다. 그래서 피차간 서로 접촉을 끊은 채 사우스 켄싱턴에서 첼시(런던 문학인 주거지)로 가는 대신 대서양을 건너 미국으로 가고자 한다. …… 두 그룹은 서로 몰이해, 때로는 적의와 혐오, 왜곡된 이미지로 크게 갈라지고 도무지 서로를 이해하려 들지 않는다. …… 비과학자들은 과학자가 인간의 조건을 알지 못하며, 천박한 낙천주의자라는 뿌리 깊은 선입관을 가지는 한편, 과학자들은 문학적 지식인이 전적으로 선견지명이 결여되어 있으며 자기네 동포에게 무관심하고, 깊은 의미에서는 반지성적이며, 예술이나 사상을 실존적 순간에만 한정시키려고 한다는 것이다. …… 요컨대 이러한 현상은 서구 전체의 문제인 것이다.

자궁내막에 존재하는 Aquaporins (AQPs)는 수분과 이온, 소분자들의 이동 및 세포의 삼투와 극성유지에 관여하며, 생식기능의 항상성 유지에 매우 중요하다. 본 연구에서는 난소절제술 동물모델과 estrogen receptor alpha (ERα) 적중 생쥐모델을 이용하여 estrogen에 의한 자궁내막 AQPs 발현 조절을 규명하고자 하였다. 8주령 ICR 생쥐 암컷의 발정주기 별 자궁조직을 획득하였고, 난소절제 후 17β-estradiol과 progesterone을 피하주사하여 자궁조직을 획득하였다. 8주령 C57BL/6 ERα 적중 생쥐에서 AQPs 발현분석을 하였으며, 난소 절제술을 수행한 ERα 적중생쥐에 17β-estradiol 주사 후 ERα, ERβ, AQP-2, -4, -5, -8, -9의 발현 변화를 확인하였다. Estrus 시기에서 AQP-4, -5, -8, -9 발현이 증가하였으며, AQP-2는 유의적인 차이가 없었다. 난소절제술 모델에서 E2 처리시 AQP-4, -5, -8, -9 mRNA의 발현이 증가하였고, ERα 적중모델에서 AQP-2 mRNA만이 ERα +/+와 ERα －/－ 모두 발현이 되었을 뿐 다른 AQP들은 발현이 없었다. 난소절제술을 수행한 ERα 적중모델에 E2 처리시 AQP-2만 발현이 되었으며, WT과 차이가 없었다. 기존 연구에서 estrogen에 의해 발현이 증가된다고 보고된 물의 선택적 투과에 관여하는 AQP-2는 ERα에 비의존적으로 발현됨을 확인하였으며, AQP-4, -5, -8, -9은 estrogen에 의해 발현이 조절되는 것으로 사료된다.

Estrogen은 estrogen receptor alpha와 beta (ERα, ERβ)를 통해 세포의 생존, 증식 및 분화를 조절한다. 남성의 체내에 미량의 에스트로젠이 존재하며, Leydig cell은 ERα와 ERβ를 발현하므로 에스트로젠은 Leydig cell의 증식 또는 스테로이드형성에 조절기능을 수행할 수 있을 것으로 추측된다. ERα가 전신적으로 적중 (ERαKO)된 수컷 생쥐는 정자형성, 스테로이드생성 및 생식력에 심대한 결함이 있다. 하지만 ERα는 뇌하수체에서도 발현되므로 전신성 ERαKO 모델로 Leydig cell 특이적 ERα의 기능을 이해하기에는 한계가 있다. 본 연구에서는 Leydig cell 특이적 ERα 적중 (ERαflox/flox Cyp17iCre) 생쥐의 정소에서 정자형성, Leydig cell의 증식과 분화특성을 규명하고자 하였다. 생후 2～14개월령의 wild type (WT)과 ERαflox/flox Cyp17iCre 수컷 생쥐를 이용하였다. WT과 ERαflox/flox Cyp17iCre 수컷 생쥐의 혈액을 채취하여 혈중 testosterone, FSH 및 LH 농도를 RIA 분석하였다. WT과 ERαflox/flox Cyp17iCre 수컷 생쥐에서 정소중량을 측정한 후, 파라핀절편을 제작하여 HE 염색을 통해 세정관의 조직학적 특징을 분석하였고, 3β-HSD 면역조직화학법으로 Leydig cell의 수, 단위세포의 면적을 이미지분석 프로그램으로 분석하였다. 또한 WT 암컷과의 교배를 통해 ER αflox/flox Cyp17iCre 수컷 생쥐의 생식력을 분석하였다. WT과 ERαflox/flox Cyp17iCre 생쥐에서 혈중 testosterone, FSH 및 LH의 농도는 유의적인 차이가 없었다. 정소 중량은 2～4개월령에서는 유의적인 차이가 없었지만 10～14개월령에서 ERαflox/flox Cyp17iCre 생쥐의 정소 무게가 WT에 비해 유의적으로 낮았다. 정자형성 장애를 보이는 세정관의 비율은 WT과 ERαflox/flox Cyp17iCre 생쥐에서 유의적인 차이가 없었다. 3β-HSD 염색을 통한 Leydig cell의 분석 결과, Leydig cell 수에는 유의적인 차이가 없었지만, 6개월령부터 ERαflox/flox Cyp17iCre 생쥐에서 WT에 비해 Leydig cell의 면적이 유의적으로 작았다. 수컷 생쥐의 나이에 따라 WT 암컷과 교배한 결과, 9～10개월령의 ERαflox/flox Cyp17iCre 생쥐에서 WT에 비해 생식력이 유의적으로 낮았다. ERαflox/flox Cyp17iCre 생쥐를 이용한 본 연구결과, Leydig cell에서 ERα는 세포의 증식보다는 노화과정에서 세포의 성장에 관여하는 것으로 사료된다. 따라서 Leydig cell에서 ERα의 결함은 세포의 성장을 저해하여 정소의 무게를 감소시키며, 또한 생식력을 저해시키는 것으로 사료된다.

부정소 상피세포에서 형성되는 밀착결합 (Tight junction, TJ)은 혈액-부정소장벽을 형성하여 정자의 수송, 저장 및 성숙에 필요한 부정소 내부환경을 조성한다. TJ는 occludin, claudins, JAMs, CAR, tricellulin 등의 integral membrane protein과 ZO-1 등의 plaque protein으로 구성된다. 한편, 정관결찰(Vasectomy)은 부정소 관강 내 삼투압 및 상피세포에서 분비되는 단백질조성을 변화시키며, 항정자항체의 형성을 유발하는 것으로 알려져 있다. 본 연구에서는 정관결찰에 따른 부정소 관강 내 정자의 성숙 및 저장환경 변화를 규명할 목적으로 부정소 상피세포 TJ 유전자 발현을 조사하였다. 생후 1, 2, 4, 8주령 부정소를 사용하였다. 생후 8주령 생쥐에서는 부정소 두부, 체부, 미부 부위별로 절취하여 분석하였다. 8주령 생쥐에 정관결찰 시행 6주 후 부정소를 획득하여 해부조직학적 변화 유무를 확인 한 후 RT-PCR 및 면역조직화학법으로 claudins (-1, -2, -3, -4, -5 -11), occludin, JAMs (-1, -2, -3), CAR, tricellulin 발현 변화를 분석하였다. Cla-2 mRNA는 두부 부정소에서만 강하게 발현하였으며, Cla-1, JAM-2 mRNA는 체부 부정소에서 다른 부위보다 강하게 발현하였다. Cla-4 mRNA는 체부 부정소에서는 거의 발현하지 않았고 두부와 미부 부정소에서 발현하였다. Occludin mRNA는 두부와 체부 부정소에서 미부 부정소보다 많이 발현하였다. CAR mRNA는 두부 부정소에서 약간 강하게 발현하였다. Cla-1, JAM-2는 principal cell에서 주로 발현하였다. Occludin, JAM-1, CAR는 apical membrane에서 발현하였으며, tricellulin은 근육층에서 발현하였다. 정관결찰 후 부정소 중량이 증가하였고 체부와 미부 부정소관이 비후는 상피세포 두께의 감소와 근육층 비후를 동반하였다. 정관결찰 모델의 두부 부정소에서 밀착결합 유전자 중 cla-2, -3, -11, JAM-2, -3, tricellulin mRNA 발현이 증가하였다. 또한 체부 부정소에서는 cla-1, -3, -4, JAM-1, -2 mRNA, 미부 부정소에서는 JAM-3 mRNA의 발현이 증가하였다. 부정소 관강 내부 정자 성숙환경 조성에 관여하는 TJ 유전자 발현은 부정소 부위별로 차등적으로 발현됨을 확인하였다. 정관결찰에 의한 부정소 상피세포의 TJ 유전자 발현의 변화는 부정소 내부의 물리적 압력의 증가와 체액 삼투압의 변화에 따른 대응기작으로 사료된다. 또한 부정소 중량 증가와 부정소 체부와 미부의 해부조직학적 변화는 부정소 부위별 분절화 특성에 관여하는 상위의 유전자 조절네트웍의 변형을 암시하므로 이에 관여하는 유전체들에 대한 연구가 필요하다.

부정소 상피세포에 존재하는 Tight junctions (TJs)는 물질 확산장벽으로 작동하며, 혈액-부정소 장벽 (blood-epididymal barrier, BEB)을 형성한다. 본 연구는 부정소 TJ 발현에 미치는 정소액의 영향을 확인하고자 수출관 결찰 (effrent duct ligation, EDL) 생쥐 부정소에서 TJ 유전자 발현변동을 조사하였다. 생후 8주령 생쥐를 정소수출관 결찰을 시행, 15일 후 부정소를 획득하여 정량적 RT-PCR법으로 TJs 유전자의 mRNA 발현을 분석, 면역조직화학법으로 단백질 발현 변화를 분석하였다. 수출관 결찰결과 EDL 부정소 중량은 감소하였고, initial segment 상피세포의 두께가 얇아졌다. EDL 부정소 두부에서 claudin-1, -11, JAM-3 mRNA 발현이 증가하였고, claudin-2 mRNA 발현은 감소하였다. 체부에서는 claudin-1, -3, -11, JAM-1, -3, tricellulin mRNA 발현이 증가하였고, tricellulin은 미부에서 mRNA 발현이 증가하였다. 면역조직화학적 분석결과, EDL 부정소 initial segment에서 claudin-2 발현이 감소하였다. CAR는 두부에서 발현이 감소하나 체부와 미부에서 증가하였다. JAM-1은 체부와 미부의 상피세포 내 발현이 증가하였다. 수출관 결찰시 initial segment TJ 조성에 많은 변화가 유발되었다. 부정소상피의 밀착결합은 정소기원의 생물학적 활성인자들의 영향하에 조절되는 것으로 사료된다.

Obesity is often associated with an impairment of the hypothalamic-pituitary-gonadal axis and also unites with reproductive defects and reduced fertility. The leptin-deficient ob/ob mouse is characterized by a morbid obesity and infertility. In the present study, we examined when ob/ob mouse lost their fertility activity according to aged dependent were investigated. The major organ systems in the body, the ovaries of females are the first to exhibit impaired function with advancing age. Here, ob/ob and ob lean various (4, 6, 9, 12 and 24 wks) aged mice were used. Histology (H & E staining) of ovary, vaginal smear and Reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) analysis were carried out. Hematoxylin/eosinstained sections show normal histology in ob lean type mice characterized by the presence of multiple primary and secondary follicles and well developed corpora lutea (CL). Ovaries from ob/ob mice, showed 4 and 6 wks mice similar to ob lean type but according to aged dependent ob/ob mice few primary and secondary follicles was seen. Many large empty follicles were present and no proper developed CL, especially 24 wks mice. Vaginal smear showed abnormal estrous cycle in ob/ob mice. Ovaries of ob/ob mice, mRNA results showed that ovulated gene TIMP1, Pgsh2 and Lhcgr expression levels are decreased according to aged dependent compared to ob lean type mice. These data suggest that aged dependent specifically when 24 wks of ob/ob mice lost their reproductive function.

Antral formation and growth during folliculogenesis are fundamental step for accomplishment both the development and extrusion of competent oocyte. Although it has been suggested that aquaproteins (AQPs) may mediate in fluid pass into the antral cavity of the follicle, many parts are still unmasked. In this study, we examined the role of AQP9 in ovulation using in vitro follicle culture system and siRNA. Expression level of AQP 9 mRNA was dramatically increased from 24 hr and kept until 56 hr (8 hr post hCG injection) after eCG injection. AQP9 mRNA level was mostly high in the theca cells of tertiary follicles and preovulatory follicles compared with granulosa cells. The healthy follicles were isolated using sharp needles at 12 hr post eCG injection (3 wks old CD-1 mice). AQP9 specific siRNAs were transfected into the theca cells with lipofectamin 2000 for 24 hr and 36 hr. After 6 hr of hCG administration into the medium, we measure the diameter of the follicles. The number of ovulated oocytes was counted at 16 hr of hCG. The follicle size was increased more than 30% in control compared with that of AQP9 siRNA treatment group. On the other hand, the ovulation rate was dramatically decreased by suppression of AQP expression (41% vs 15% respectively in control and siRNA). At eCG 48 hr, we cannot find any ovulation marker changed in siRNA treatment group. From these results, we know that AQP9 accelerates the antral growth and ovulation.

Previously we have succeeded to isolate stem cells (HEAC) from human eyelid adipose tissue, and functionally differentiate them into insulin-secreting cells. In the present study, we examined whether insulin family members might affect the insulinogenic differentiation of HEAC. Insulin treatment during culture affected little on the insulin and c-peptide secretions from HEAC after culture. However, insulin-like growth factor (IGF) 1 treatment decreased both secretions, whereas IGF2 greatly increased the secretions in a glucose-dependent manner. HEAC treated with IGF2 showed stronger expression of Pdx1, Isl1, Pax6 and PC1/3 genes compared to the control. They also showed distinct staining with insulin and c-peptide antibodies, and dithizone. While insulin or IGF2 treatment increased total cell number by 1.3- or 1.5-fold, respectively, each treatment increased the amount of insulin secretion by 27.1- or 78.1-fold, respectively. IGF2-enhanced insulinogenic differentiation was completely blocked by an antibody against insulin receptor (IR), but not by an antibody against IGF1 receptor (IGF1R). Differentiated HEAC showed expression of both IR and IGF1R genes while they expressed neither IGF2 nor IGF2R genes. Based upon these results, it is suggested that whereas IGF1 might inhibit the insulinogenic differentiation of HEAC, insulin and IGF2 could enhance the differentiation, and that the enhancing effect could be mediated via IR.

Mesenchymal stem cells constitute an potential cellular source to promote brain regeneration with Parkinson's disease. Mesenchymal stem cells have significant advantages over other stem cell types and greater potential for immediate clinical application. The purpose of this study was to investigate whether hMSCs from the human adipose tissue could be induced to differentiate into dopaminergic cells and to assess the developmental potential of hMSC for selectively replacing the midbrain dopamine neurons lost in Parkinson's disease in vitro and in vivo. MSCs were cultured under conditions that promote differentiation of dopaminergic neuron. Using media that include SHH, FGF8, and GDNF. the MSCs were induced in vitro to become dopaminergic neurons. The expressions of the LIM homeobox transcription factor 1, alpha (Lmx1a), tyrosine hydroxylase(TH) proteins were determined by immunofluorescence. Lmx1a has been shown sufficient to confer neurogenic activity on mesencephalic floor plate cells and to determine a mesencephalic dopaminergic neurons fate. This result suggests that hMSCs have the ability to differfentiate into dopaminergic neurons. hMSCs were then transplanted into the striatal in a rat model of Parkinson's disease. The rats were unilaterally lesioned in the substantia nigra with 6-hydroxydopamine and were tested for rotational apomorphine-induced behavior. Following differentiation of dopaminergic neuron, cells displayed dopaminergic morphology and that they expressed dopaminergic marks genes. Finally transplantation of hMSCs into the striatal of Parkinsonian rats resulted in improvement of their behavioral deficits by apomorphine-induced rotational behavior. The hMSCs transplanted rats were proved to be better than compared with the transplantation of PBS. Immunohistochemical analysis of grafted brains revealed that abundant hMSCs survived from the grafts and some of them displayed dopaminergic marks. Our results indicate that hMSC may serve as a good cell source for the treatment of neurodegenerative diseases and have high potential for being used in multiple applications. This cellular approach might become a restorative therapy in Parkinson's disease.

Mesenchymal stem cells (MSCs) has been reported as multipotent progenitor cells that can be expanded rapidly in vitro and differentiated into multiple mesodermal cell type. Human MSCs have been reported to be associated with neural differentiation especially in the cholinergic phenotype in several neural system. In this study, We investigated the ability of MSCs derived human aipose tissue to differentiation into neural cells expressing Islet-1 and further differentiates into cholinergic neurons in cholinergic differentiation media. Immunocytochemistry was performed to detect the expression of Islet-1 and demonstrate characteristic of neurons and cholinergic neurons. Islet-1 was massively detected in the induction stage. Following cholinergic differentiation from Islet-1-expressing MSCs, Cholinergic neuron marker ChAT was higly expressed. Also we examined the neuroprotective effects and neural differentiation of transplanted human adipose tissue-derived mesenchymal stem cells (AT-MSCs) in ischemic stroke. For transplantation, after 3days after MCAO. animal were divided into 2 group: Group A : injected phosphate buffered saline (PBS;5 ㎕ n=10), Group B: transplanted AT-MSCs (5×105 cells, n=10). Each animal received an injection into the right penumbra region (from bregma : AP;－1.3 ㎜, ML;－4.0 ㎜, DV;－5.9 ㎜). In all animals, behavior test were performed at 1, 3, 6, 9, 12, 15 days after MCAO, that was conducted by investigators who were blined to the experimental groups. mNSS test demonstrated that motor, sensory, and balance behavior were impaired after MCAO ischemic insult. Ischemic rats that received AT-MSCs exhibited significantly improved functional performance compared with PBS injected animals and histological analysis revealed that transplanted AT-MSCs expressed marker for neuron. These results suggest that AT-MSCs can be differentiated into neuron especially in cholinergic neuron and may be a potential source of treatment for neurodegenerative disease such as stroke.

인간 배아줄기세포는 모든 종류의 세포로 분화할 수 있는 전분화능을 가지고 있어, 이를 이용한 심근세포로의 분화 및 기능 분석에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다. 분화된 심근세포는 심근세포 특이적 유전자의 발현 및 기능성 등의 특성을 나타내는 것으로 알려져 있다. 본 연구에서는 심장의 자발적 박동 (autonomic rhythm)을 설명하는 전기생리학적 기전들 중 하나인 과분극-활성 양이온통로 (hyperpolarization and cyclic nucleotide-activated (HCN) family)의 발현 여부를 분석하였다. 미분화 인간 배아줄기세포에 10 ng/㎖ BMP2를 4일 동안 처리하여 심근전구세포로의 직접 분화를 유도하였다. 분화유도 18일 후, 세포를 PBS로 세정한 뒤, trizol을 이용하여 RNA를 추출하였다. 1 ug의 RNA를 이용하여 cDNA를 합성한 후, 칼슘채널 특이 유전자의 발현을 RT-PCR 방법을 이용하여 측정하였다. 또한, 칼슘 특이적 시약인 fluo-4를 염색하여 자발적 수축현상과 연관되어 세포내 칼슘농도변화가 동반되는지 확인하였다. 직접분화법을 이용하여 분화된 인간 배아줄기세포 유래 심근세포는 분화유도 14일 후에 박동을 나타내었으며, 칼슘채널 특이적 유전자 hyperpolarization and cyclic nucleotide-activated(HCN) family에 속하는 HCN-1, -2, -4 등을 발현하였다. 또한, 이처럼 분화된 심근세포에서 fluo-4 형광의 주기적 증감이 나타나는 것을 확인하였다. 이러한 현상들 자발적 박동 시작 후 4일째에 최고치를 보였다. 본 연구에서는 인간 배아줄기세포 유래 심근세포에서 pacemaker channel의 역할을 하는 HCN family의 존재 및 관련 유전자의 발현을 확인함으로써, 인간 배아줄기세포 유래 심근전구세포의 기능성을 제시하는 바이다.

A stroke is the major cause of death and can cause neurological damage. The striatum serves as an input gate of the basal ganglia in assisting motor behavior. The activity-dependent synaptic plasticity in the dorsal striatum (DS) is known to play a key role for recovery of motor control after brain injury. Exercise supports functional recovery from ischemic brain injury through brain-derived neurotrophic factor (BDNF) -induced synaptic plasticity. Exercise upregulate the levels of BDNF within both the hippocampus and cerebral cortes and might act as a gate that primes the brain to respond to environmental stimulation, while simultaneously increasing the ability of neurons to resist insult. However, little is known about the effects of exercise on neuroprotection in the DS. Therefore, in this study we attempted to investigate the effects of exercise on the neuronal cell population in the DS. Transient focal brain ischemia was induced by middle cerebral artery occlusion (MCAO) on male Sprague-Dawley rats (300±30). Animals were subjected to forced treadmill exercise group and sedentary group after MCAO. Exercise improved neurologic functions measured by modified neurological severity score. Exercise group showed reduced infarct volume measured by vital staining with 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride. Immunohistochemical analysis was performed in the DS with antibodies of neuronal nuclei (NeuN) protein, glial fibrillary acidic protein (GFAP), a matured neuronal marker and an astrocyte marker respectively and BDNF. Ischemic injury decreased NeuN+ cell population but exercise attenuated this decrease while increase in GFAP+ cell population induced by MCAO was inhibited by exercise. These findings suggest that the neurological function recovery by exercise after ischemic brain injury may be mediated by alteration of neuronal cell population in the DS.

Sperm specific non selective cation (CatSper) channels belong to the CatSper family of genes and are expressed only in sperm and testis. In general, gene expression profiles in the brains of humans and mice share the highest similarity with those in testis. Therefore, to identify whether CatSper genes are expressed in the mouse brain, we performed reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR) and Western blotting. RT-PCR detected all four CatSper mRNAs in both the testis and the brain, with CatSper3 being the most highly expressed. Consistent with RT-PCR data, Western blot analysis showed that CatSper3 was expressed in the brain. We cloned CatSper3 variant 2 from eight-week mouse brain. We named the gene as CatSper3 variant 1 (V1) because the mouse CatSper3 is orthologous to human CatSper3, and another mouse CatSper3 variant (variant 2, V2) with truncated second transmembrane helix was identified. The open reading frame of mCatSper3 V1 consists of 1185 nucleotides and encodes a putative 395-amino acid protein. At the amino acid level, CatSper3 isolated from brain is 100 and 64.8% identical to that isolated from mouse testis and human CatSper3, respectively. Based on comparison between the mCatSper3 V1 ORF and mCatSper3 V2 using TopPred software, the alignment of amino acid sequences shows that the differences exist mainly in segment 2. The CatSper3 transcript consists of eight exons and seven introns, and alternative splice is present within the third exon. In HT22 cell, a mouse hippocampal neuronal cell line, H2O2-induced changes in CatSper3 expression were studied. H2O2 dramatically increased CatSper3 expression in HT22 cells in a dose-and time-dependent manner. The H2O2-induced increase in CatSper3 expression was offset by the addition of N-acetylcysteine (NAC), which is an antioxidant. Taken together, these data strongly indicate that CatSper3 is expressed in mouse brain as variant 1 and suggest that CatSper3 could be a potential target for the modulation of ROS.

Implantation of the blastocyst into the maternal endometrium, mediated by well-differentiated primary cells of the placenta known as trophoblasts, grow in an invasive via complicated interaction with immune cells in the maternal myometrium. Placenta-derived stem cells (PDSCs), which is a fetal origin, display multi-lineages differentiation potential, and they are free of ethical concerns, easily accessible, abundant, and strongly immunosuppressive. However, the efficiency of PDSCs according to trophoblast invasion or immune modulation in implantation has not yet been evaluated. Here, we investigated the effects of PDSCs for trophoblast invasion as well as their potential for immune modulation of activated T cells when they co-cultured with PDSCs. Activated T cells and HTR-8SV/neo trophoblast cells were co-cultured with PDSCs according to cell dose-dependent manner. Activities for proliferation of T cells were analyzed by BrdU incorporation assay and cell invasions were estimated. Activation of T cells was significantly decreased in the group co-cultured with PDSCs comparing to normal fibroblast cells (p<0.05). In addition, trophoblast invasion by PDSCs have recorded a twofold increase than the normal fibroblast cells. These results contribute to our understanding of the potential roles of PDSCs, including immune modulation effects for trophoblast invasion in pregnancy, and provide a foundation for the development of new cell therapy-based strategies for the treatment of women with implantation.