Human embryonic stem (hES) cell lines have been derived from human blastocysts and are expected to have far-reaching applications in regenerative medicine. The objective of this study is to improve freezing method with less cryo-injuries and best survival rates in hES cells by comparing various vitrification conditions. For the vitrifications, ES cells are exposed to the 4 different cryoprotectants, ethylene glycol (EG), 1,2-propanediol (PROH), EG with dime-thylsulfoxide (DMSO) and EG with PROH. We compared to types of vehicles, such as open pulled straw (OPS) or electron microscopic cooper grids (EM grids). Thawed hES cells were dipped into sequentially holding media with 0.2 M sucrose for 1 min, 0.1 M sucrose for 5 min and holding media for 5 min twice and plated onto a fresh feeder layer. Survival rates of vitrified hES cells were assessed by counting of undifferentiated colonies. It shows high survival rates of hES cells frozen with EG and DMSO (60.8％), or EG and PROH(65.8％) on EM grids better than those of OPS, compared to those frozen with EG alone (2.4％) or PROH alone (0％) alone. The hES cells vitrified with EM grid showed relatively constant colony forming efficiency and survival rates, compared to those of unverified hES cells. The vitrified hES cells retained the normal morphology, alkaline phosphates activity, and the expression of SSEA-3 and 4. Through RT-PCR analysis showed Oct-4 gene expression was down-regulated and embryonic germ layer markers were up-regulated in the vitrified hES cells during spontaneous differentiation. These results show that vitrification method by using EM grid supplemented with EG and PROH in hES cells may be most efficient at present to minimize cyto-toxicity and cellular damage derived by ice crystal formation and furthermore may be employed for clinical application.

돌산갓에서의 glucosinolates인 sinigrin의 분석법을 확립하기 위해 다양한 용매를 이용하여 추출 후 정성·정량하였다. 돌산갓을 뿌리, 줄기, 잎으로 구분하여 50% CH3CN, 10% NH4Cl, 60% CH2OH, 70% CH3OH 을 이용해 추출 시 50% CH3CN이 가장 sinigrin 함량이 높게 나타났으며 나머지 용매들은 큰 차이가 없었다. 또한 갓 부위별에서 sinigrin함량은 큰 차이가 없었으며 줄기 부위의 50% CH3CN추출물의 sinigrin함량이 728 ppm으로 다소 높게 나타났다. Sinigrin은 농도별로 standard curve를 작성하여 HPLC에 의한 돌산갓 부위별 sinigrin 함량을 정량화 하였고 HPLC로 분석시 UV detector 감도는 242 nm보다 228 nm에서 높게 나타났으며 228 nm에서는 줄기, 뿌리, 잎 순서로 sinigrin함량이 나타났다. 50% CH3CN로 추출한 돌산갓의 chromatogram은 표준물질인 sinigrin의 retention time과 일치하였으며, 잎에서 나타난 peak는 glucosinolates인 glucoraphanin으로 확인되었다. 본 연구의 결과로부터 돌산갓에 함유된 sinigrin 분석을 위한 추출용매는 50% CH3CN, UV detector 파장은 228 nm가 가장 적합하다는 것을 알 수 있었다. 또한, sinigrin의 추출 및 분석이 체계화됨으로써 돌산갓을 이용한 다양한 식품의 저장기간에 따른 sinigrin 함량변화 및 생리기능에 관한 연구에 활용 될 수 있을 것으로 판단된다.

인간 배아줄기세포는 모든 종류의 세포로 분화할 수 있는 전분화능을 가지고 있어, 이를 이용한 심근세포로의 분화 및 기능 분석에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다. 분화된 심근세포는 심근세포 특이적 유전자의 발현 및 기능성 등의 특성을 나타내는 것으로 알려져 있다. 본 연구에서는 심장의 자발적 박동 (autonomic rhythm)을 설명하는 전기생리학적 기전들 중 하나인 과분극-활성 양이온통로 (hyperpolarization and cyclic nucleotide-activated (HCN) family)의 발현 여부를 분석하였다. 미분화 인간 배아줄기세포에 10 ng/㎖ BMP2를 4일 동안 처리하여 심근전구세포로의 직접 분화를 유도하였다. 분화유도 18일 후, 세포를 PBS로 세정한 뒤, trizol을 이용하여 RNA를 추출하였다. 1 ug의 RNA를 이용하여 cDNA를 합성한 후, 칼슘채널 특이 유전자의 발현을 RT-PCR 방법을 이용하여 측정하였다. 또한, 칼슘 특이적 시약인 fluo-4를 염색하여 자발적 수축현상과 연관되어 세포내 칼슘농도변화가 동반되는지 확인하였다. 직접분화법을 이용하여 분화된 인간 배아줄기세포 유래 심근세포는 분화유도 14일 후에 박동을 나타내었으며, 칼슘채널 특이적 유전자 hyperpolarization and cyclic nucleotide-activated(HCN) family에 속하는 HCN-1, -2, -4 등을 발현하였다. 또한, 이처럼 분화된 심근세포에서 fluo-4 형광의 주기적 증감이 나타나는 것을 확인하였다. 이러한 현상들 자발적 박동 시작 후 4일째에 최고치를 보였다. 본 연구에서는 인간 배아줄기세포 유래 심근세포에서 pacemaker channel의 역할을 하는 HCN family의 존재 및 관련 유전자의 발현을 확인함으로써, 인간 배아줄기세포 유래 심근전구세포의 기능성을 제시하는 바이다.