Tissue engineering (TE) has been developed to create functional organs and tissue by combining 3D matrix and cells in vitro. Vascularization and angiogenesis are utmost important for supply of nutrients and oxygen in tissue engineered organs. The present study was performed to isolate and characterize primary endothelial cells (EC) from aorta of alpha 1, 3-enzyme galactosyltransferase knock out (GalT KO) pig, to minimize immune rejection and analyze body immune system for future xenotransplantation studies. Isolation of primary EC from aorta were performed by incubation with dispase for 8-10 min at 37°C. Primary EC were cultured in EC growth medium on different extra cellular matrix (ECM), either collagen or gelation. Primary EC exhibits morphological characteristics and showed positive expressions of EC specific marker proteins i.e. PECAM1, KDR and VWF despite of their ECM surface; however, on collagen based surface they showed increase in mRNA level analyzed by qPCR. Primary EC cultured on collagen were sorted by flow cytometer using KDR marker and cultured as KDR positive cells and KDR negative cells, respectively. KDR positive cells showed dramatically increased in PECAM1 and VWF level as compared to KDR negative cells. Based on the above results, primary EC derived from GalT KO are successfully isolated and survived continuously in culture without becoming overgrown by fibroblast. Therefore, they can be utilize for xeno organ transfer, tissue engineering, and immune rejection study in future.

최근 조직공학 기술의 발달로 재해와 질병으로 인한 손상된 조직과 장기의 대체연구들 이 진행되고 있다. 장기 대체 연구의 핵심 요소 중 하나는 재건된 조직이나 장기가 혈관 망을 형성하여 host tissue로부터 양분과 산소의 전달이다. 본 연구는 조직공학 기법을 이용하여 장기 재건에 필수적인 혈관 재건을 위해 혈관을 구성하는 주세포인 endothelial cell을 체외에서 배양하는 것이다. Endothelial cell(EC)배양을 위해서는 세포지지체인 세 포외 기질(External cellular metrics, ECM)을 필요로 하기 때문에 ECM중에 대표적인 collagen과 gelatin을 사용하여 지지체에 따른 체외배양능을 비교하였다. 실험 동물로는 돼지 대동맥을 채취하여, 대동맥 속에 collagenase type I을 주입하고, 혈관의 입·출구를 봉합한 상태로 10분 간 37℃에서 처리하였다. 관류된 용액은 10% FBS가 함유된 기본배 양액(EGM-2 media)을 사용하여 2번 수세한 후 회수된 세포를 각각의 ECM이 처리된 dish위에서 배양 하였다. EC세포인지를 확인하기 위해서 EC표지 인자인 CD31과 vWF 항체의 발현을 flow cytometry로 확인 하였고, 회수된 세포에서 두 단백질이 모두 발현 되었다. ECM에 따른 EC의 세포 형태를 비교하였을 때 형태학적 차이는 없었다. Basement Membrane Extract위에서 calcein-AM으로 염색된 EC는 ECM의 종류와 상관 없이 2-6시간 사이에 Tube Formation을 보였다. 또한 endothelial cell의 표지 마크인 CD31, Flk1, vWF의 mRNA 발현양과 IHC에 의한 단백질 발현을 조사한 결과 collagen 지지체 위에서 배양된 endothelial cells에서 발현양이 더 높았다. 결론적으로 두 가지 ECM에서 모두 성공적으로 endothelial cell의 배양이 가능하지만 collagen위에서 배양된 endothelial cell이 더 우수한 maintenance능력을 가짐을 확인 할 수 있었다.

노화와 재해 등으로 인한 인간의 치명적인 간 부전 문제를 해결하기 위한 대안 중의 한 축으로 교차분화 기법을 적용한 induced hepatocyte (iHep)연구가 진행되고 있지만, 분화효율은 극히 낮다. 본 연구에서는 돼지 섬유아세포에 교차분화기법을 사용하여 piHep을 만들고, 소분자 화합물(A83-01)의 첨가에 따른 교차분화의 효율개선을 시도 하 였다. piHep의 유도를 위해서 세가지 간 전사 인자를 [human hepatocyte nuclear factor 1 alpha (hHNF1A), human hepatocyte nuclear factor 4 alpha (hHNF4A), human forkhead box protein A3 (hFOXA3)]를 렌티바이러스를 이용하여 체세포에 도입하였다. 3가지 유전자가 도입된 세포는 기본 배양액으로 hepatocyte induction medium (HIM)을 사용하였고, 여기에 A83-01을 첨가군과 미 첨가군(대조군)으로 나누어 교차분화를 유도 하였다. 그 결과 대조군에서 4주 후에 불완전한 간세포의 형태가 낮은 빈도로 나타났지 만, A83-01 처리군은 도입 2주 후부터 epithelial-like cell의 형성을 통해 점점 다핵을 가 지는 성숙한 piHep(명확한 핵, 다각형의 세포질)의 특성이 확인되었다. 간세포로의 기능 적 분화를 검증하기 위해 albumin (ALB)과 transferrin (TF)의 mRNA의 발현을 real-time PCR을 통해 분석하였다. A83-01 처리군에서 ALB와 TF의 발현이 교차분화 4 주차까지 증가되었다. 섬유아세포 표지 인자인 vimentin의 발현은 A83-01의 처리와 상관 없이 모두 감소되었다. 대조군과 달리 A83-01처리군은 piHep의 유도를 위해 사용된 3가 지 간 전사인자들 중 HNF4Α와 FOXA3에서 교차분화 후 4주차까지 endogenic expression 을 보였다. 결론적으로 간세포 교차 분화의 효율 개선을 위해 사용된 A83-01은 돼지 섬 유아세포의 내재된 간 특이적 전사 인자들을 활성화시켜 간세포의 분화를 촉진함을 확인 할 수 있었다.

There is a growing interest in the application of primary hepatocytes for treatment of liver diseases in humans and for drug development. Several studies have focused on long-term survival and di-differentiation blocking of primary hepatocytes in an in vitro culture system. Therefore, the present study also aimed to optimize an in vitro culture system using primary rat hepatocytes. Primary rat hepatocytes from 6-week-old male Crl:CD rats were isolated using a modified two-step collagenase perfusion. Healthy 3.5 × 106 primary rat hepatocytes were seeded into a 2 dimensional (2D) culture in a 25T culture flask coated with collagen type I or into a 3D culture in a 125-ml spinner flask for 7 days. Production of plasma protein (ALB and TF), apoptosis (BAX and BCL2), and CYP (CYP3A1) related genes were compared between the 2D and 3D culture systems. The 3D culture system had an advantage over the 2D system because of the relatively high expression of ALB and low expression of BAX in the 3D system. However, the level of CYP3A1 did not improve in the 3D culture with and without the presence of a dexamethasone inducer. Therefore, 3D culture has an advantage for albumin production and primary rat hepatocyte survivability, but a low expression of CYP3A1 indicated that primary rat hepatocytes require a high–density culture for stress reduction by continuous flow.