BCAP 유전자를 지니는 pRB374-BCAP2와 pLip-BCAP2를 B. clausii I-52에 도입 후, 염색체 integration에 의해 구성된 pHPS9-BCAP 형질전환체(B. clausii C5)와 alkaline protease 발현율을 비교하였다. 최적화 배지(대두박 2%, 밀가루 1%, 구연산나트륨 0.5%, K2HPO4 0.4%, Na2HPO4 0.1%, NaCl 0.4%, MgSO4⋅7H2O 0.01%, FeSO4⋅7H2O 0.05%, 물엿 2.5%, 탄산나트륨 0.6%)에서 액침배양(37℃, 48 h, 650 rpm, 1 vvm) 시, pRB374- BCAP2 및 pHPS9-BCAP 형질전환체 각각은 15% 및 61% 정도 alkaline protease 생산이 증가하였다. 그러나 pLip-BCAP2 형질전환체에서는 변화가 없었다. 최고의 활성 균주인, B. clausii C5를 300 L 규모 pilot-scale 액침 배양(37℃, 30 h, 250 rpm, 1 vvm) 시, alkaline protease 생산은 105,685 U/mL로 측정되었다.

인천 연안 갯벌에서 분리한 호알카리성 Bacillus clausii I-52로부터 세포외 알카리성 단백질 분해효소(BCAP)의 발현 및 생산성을 증가시키기 위하여 BCAP promoter, ribosome 결합 서열, 신호서열, 전구체 서열 및 활성형 BCAP 유전자를 cloning한 재조합 plasmid pHPS9-fuBCAP을 penicliin-protoplast 법으로 B. clausii I-52의 염색체 DNA에 integration 하였고, 도입된 plasmid pHPS9-fuBCAP 유전자는 PCR에 의해 확인하였다. 가장 높은 단백질 분해효소 상대 활성을 보이는 선별된 transformant C5를 생산 최적화 배지(대두박 2%, 밀가루 1%, 구연산나트륨 0.5%, K2HPO4 0.4%, Na2HPO4 0.1%, NaCl 0.4%, MgSO47H2O 0.01%, FeSO47H2O 0.05%, 물엿 2.5%, 탄산나트륨 0.6%)에서 액침 배양법(배양온도, 37℃; 배양 시간, 48 h; 교반 속도, 650 rpm; 통기 속도, 1 vvm)으로 배양하여 단백질 분해효소를 발현 및 분비시켰을 때, BCAP 발현 양(134,670 U/ml)은 wild-type(83,960 U/ml)에 비하여 약 1.6 배 증가하였으며, 비활성도(91,611.5 U/mg 단백질)는 wild-type(71,760 U/mg 단백질)에 비하여 약 1.3 배 증가하였다. 또한, B. clausii I-52 염색체 DNA에 integration된 pHPS9-fuBCAP plasmid는 단백질 발현과 함께 8일간의 계대배양 동안에 안정하게 유지되고 있음을 확인하였다.

아세틸콜린 분해효소(acetylcholine esterase, AChE) 억제제는 아세틸콜린 함량을 높여 콜린성 neuron 을 활성화함으로써 기억 능력의 개선 및 치매 개선을 가져와 현재 다양한 AChE 억제제들이 개발되어 사용되고 있다. 본 연구에서는 AChE에 대한 억제 활성을 갖는 천연물을 다양한 식물추출물 및 에센스오일로부터 탐색하였으며, 탐색한 추출물의 scopolamine으로 기억손상을 유발한 쥐의 기억력 개선 활성을 치매 치료제로 사용하고 있는 donepizil과 비교 분석하였다. 그 결과 자몽(Citrus paradisi) 유래의 에센스 오일이 AChE 억제 활성이 가장 높아 20 ug/ml의 농도로 처리하였을 때 90% 이상의 효소 억제 활성을 나타내었다. 수동회피 실험 결과, 자몽 유래의 에센스오일(100 mg/kg, p.o.)을 투여한 쥐는 치매 치료제로 사용하고 있는 donepizile (0.5 mg/kg)을 투여한 쥐와 유사한 latency time을 나타내어 인지기능이 개선되었다. 또한, 수중미로 시험 결과, 자몽 유래 에센스오일(100 mg/Kg, p.o.)을 투여한 쥐는 donepizile(0.5 mg/kg)을 투여한 쥐와 유사한 latency time을 나타내어 인지기능이 개선되었다. 이상의 결과로부터 자몽 유래 에센스오일은 매우 효과적으로 기억력을 개선하여 인지기능을 개선해 줄 수 있는 안전하고 효과적인 후보물질이라고 사료된다.

인천 연안의 심하게 오염된 갯벌로부터 강력한 세포외 알카리성 단백질 분해효소를 생산하는 호알카리 성 Bacillus clausii I-52를 분리하였으며, 이 균주로부터 알카리성 단백질 분해효소의 유전자를 cloning 하여 서열 분석을 하였다. Chromosome 서열이 완전히 밝혀진 Bacillus subtilis의 서열을 기초로 하여 알카리성 단백질 분해효소 및 promoter를 포함하도록 primer를 고안하여 PCR을 수행하여 2,277 bp의 DNA 단편을 얻었으며 BLAST 분석 결과 29 개의 아미노산으로 이루어진 signal peptide, 77 개의 아미 노산으로 이루어진 propeptide 및 275 개의 아미노산을 갖는 활성형의 BCAP으로 구성된 총 381 개의 아미노산을 코딩하는 1,143 bp의 open reading frame을 확인하였다. 활성형 BCAP의 N-말단 아미노산은 Ala이며, 분자량 및 pI 값은 각각 27698.7 Da과 6.30으로 계산되었다. 아미노산 상동성을 분석한 결과, B. subtilis 유래의 nattokinase precursor 및 B. subtilis BSn5 유래의 subtilisin E precursor와 99%의 서열 상동성을 나타내어 B. clausii I-52 유래의 BCAP은 subtilisin 계열의 단백질 분해효소임을 확인하였다. E. coli BL21(DE3)에서 발현한 재조합 BCAP는 N-Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA 를 효율적으로 분해하였다. Refolding한 재조합 BCAP은 전형적인 serine protease inhibitor인 PMSF에 의하여 강하게 효소 활성이 억제됨으로써 serine protease 계열의 단백질 분해효소임을 알 수 있었다.