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pp.218-227
반복성 염기서열을 응용한 PCR법인 REP-PCR을 사용하여 식중독 미생물의 분리와 동정을 위한 연구에 적용하기 위하여 주요 식중독 유발세균 5속(genus), 6종의 균주를 사용하여 실험을 실시하였다. PCR 구성성분인 MgCl2, dNTPs, REP sequence primer, 주형 DNA의 농도를 최적화하기 위한 연구 결과, MgCl2의 농도가 2.0 mM과 2.5 mM일 때, 균주들의 fingerprinting pattern의 변화가 없거나 적은 것으로 관찰되어, 모든 속의 균주를 단일조건으로 분리?동정하기 위해서 MgCl2의 농도는 2.5 mM이 최적인 것으로 결론을 내렸다. dNTPs는 50 μM의 농도를 적용하였을 때부터 전체 fingerprinting pattern범위의 주 단편들을 나타내는 균주들도 있었으나 총 단편의 수가 완벽하게 나타나지는 않았고, 200 μM의 적용시점에서 6종의 균주 모두 단편의 수나 강도의 변화가 관찰되지 않았기 때문에 fingerprinting pattern의 파악을 위한 목적에는 200 μM의 dNTPs 농도만으로도 충분하였다. REP primer는 적용한 농도가 증가함에 따라 단편의 수와 강도가 증가하였으며 Vibrio를 제외한 5종의 균주가 2.0 μM의 primer를 적용했을 때 고유한 fingerprinting pattern을 나타냈다. 주형 DNA의 양을 변화시켜 적용하였을 때 DNA 양의 비율이 2배에서 5배까지 증가하여도 초기 미량 적용 시 생성되었던 fingerprinting pattern은 많은 차이를 보이지는 않았다. 그러나 적용되는 DNA 양에 따라 단편들의 강도와 수가 약간씩 점증하는 양상을 보였다.
This experiment was conducted to optimize REP (repetitive extragenic palindromic sequence)-PCR reaction conditions in order to simultaneously differentiate the five different foodborne pathogenic bacterial genera of Escherichia, Salmonella, Shigella, Vibrio and Listeria. The four major PCR cocktail components of MgCl2, dNTPs, primers and template DNA were considered and their optimum concentrations were determined using six reference strains. The optimized concentration of MgCl2 was determined to be 2.5 mM in order to obtain a consistent fingerprinting pattern. The similar fingerprinting pattern was obtained when REP primers and dNTPs were added up to the concentrations of 2 μM and 200 μM, respectively. As for template DNA, the numbers of PCR fragments were not mostly affected, but their intensities were slightly increased as the concentrations of the DNA were increased from 2 times to 5 times.
