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무당개구리(B. orientalis)의 수정란은 수정 후 약 24h에 원구입술을 형성하며, 이 원구의 고리를 통해 이동하는 세포가 중배엽을 형성하고, 중배엽의 수렴확장에는 noggin, chordin, follistatin이 큰 영향을 미친다. Mercuric chloride는 높은 독성, 생물 농축적 특성을 갖는 가장 위험한 중금속 중 하나이다. 본 연구는 양서류 초기배아의 중배엽 형성과정에서 수은 이온에 의해 유발되는 중배엽 발생저해 효과를 DMZ explants를 이용하여 체외분석 및 유전자 발현 분석하였다. 무당개구리 배아는 hCG를 주사하여 획득하였으며, 획득한 배아는 22℃에서 발생시켰다. 동물극 유도 시에는 후기 포배의 배아 동물극 정중앙을 1～2 mm 크기로 절개하여 이용하였고, DMZ 분리는 원구입술의 크기가 배아 둘레 기준으로 약 1/8 정도 확장된 배아가 되었을 때 절개하여 실험에 사용하였다. 24-well tissue culture plate에 1X MR로 조제한 1.5% agarose 고체배지 500μl에 1X MR, penicillin(1μl/ml), streptomycin(10μl/ml), BSA(0.25μl/ml)로 조제한 액체 배양액 500μl를 첨가하여 배양하였다. 동물극의 중배엽 유도를 위한 실험군에는 추가적으로 Activin-A를 2.0 ng/ml의 농도로 처리하였다. Mercuric Chloride는 3차 증류수에 녹인 후 0(vehicle control group), 0.1, 1, 10 μM의 농도로 배양액에 처리하여 20℃에서 배양하며, 12시간 경과 후 DMZ explant의 수렴확장 정도를 이미지 분석프로그램을 통해 수치화 하였다. 배양된 explants는 RT-PCR을 이용하여 cDNA로 합성하고, noggin, chordin, follistatin의 발현량을 측정하였다. 실험결과, 동물극의 중배엽 유도 실험에서는 확장 정도를 의미하는 길이신장은 10μM(2.715 mg/L) 처리군에서 유의적으로 감소하였다. 수렴 정도를 의미하는 동물극 신장 부위의 두께는 10μM(2.715 mg/L) 처리군에서 유의적으로 감소하였다. 반면, 종합적인 수렴확장 정도의 비교를 위한 길이/폭 비율에서는 유의적인 차이가 발견되지 않았다. DMZ explant의 확장 정도를 의미하는 길이신장은 10μM(2.715 mg/L) 처리군에서 유의적으로 감소하였다. 반면, 수렴 정도를 의미하는 DMZ explant 두께는 수은이온처리에 따른 차이가 발견되지 않았다. 종합적인 수렴확장 정도의 비교를 위한 길이/폭 비율은 10μM(2.715 mg/L)의 수은이온 처리군에서 유의적으로 감소하였다. 유전자 발현량 측정 결과, 동물극의 중배엽 유도 실험에서는 noggin의 경우 1, 10μM에서, chordin의 경우 0.1, 1, 10μM에서, follistatin의 경우 1, 10μM에서 감소하는 양상을 보였다. DMZ explant 배양에서는 통계적으로 유의한 수렴확장저해가 확인되지 않았다. 무당개구리 배아를 이용한 Mercuric Chloride의 중배엽 형성저해 분석 결과, 10μM(2.715 mg/L) 이상의 농도는 DMZ의 길이 성장, 길이/폭 비율을 저해시키며, 동물극의 중배엽 형성 유도에서는 길이 성장, 폭 성장을 저해시키는 것으로 확인되었다. 동물극의 중배엽 유도군에서 수렴 확장 정도에서의 변화가 나타나지 않은 것은 길이와 폭의 성장이 모두 저해되었기 때문에 비율의 변화값이 고정되었음에 따른 것으로 사료된다. 또한 유전자 발현양상을 분석한 결과 길이 측정결과에서 보였던 결과와 마찬가지로 농도 의존적으로 감소하는 양상을 보였으므로 수은이 중배엽 형성을 저해하는 효과를 가졌음을 확인할 수 있었다. 단, DMZ explant 군에서의 변화양상이 없는 것으로 보아, 차후 중배엽 형성 저해 실험을 관찰할 때에는 동물극 유도 실험군을 이용하는 것이 더 바람직할 것으로 사료된다.
