논문 상세보기
pp.81-90
이 연구의 목적은 근육 세포의 증식 배양을 위해 필요한 핵심 인자인 혈청이 혈청 대체물의 첨가에 의해 대체될 수 있는지를 분자 생물학적 측면에서 검증하는 것이다. 혈청 대체물이 첨가된 low serum (5% FBS) 기반의 promo cell 배지는 성장 배양액으로 사용되었고, 마우스 하지 골격근의 근육세포는 pre-plating (pp) 방법에 의해 분리되었다. Pre-plating 4의 세포는 작고 둥근 형태의 굴절성을 가진 Myoblast/satellite like cells의 형태가 관찰되었으며, 근육 줄기세포 전사인자들(Pax3/7, Myf5, Myod1)과 골격근 발달 전사인자(Myog)의 발현량이 섬유아세포와 비교하여 높게 나타났다. 따라서 그들을 Myoblast derived cells로 명명하고, 기본 세포주로 사용하였다. 분리된 MDCs는 5%, 10% 혹은 20% 혈청이 첨가된 배양액에서 2주간 배양되었다. 배양 6일째부터 대조군(5% 혈청)과 비교하여 20% 혈청은 세포 수가 증가하였으며, 양적 혈청 농도 의존성이 확인되었다. 증식 및 세포사멸 관련 유전자들은 대조군과 비교하였다. 배양 1주 차에 20% FBS군은 세포증식 촉진 유전자인 Myc 발현이 증가한 반면 pro-apoptosis 유전자인 Bax의 발현량이 감소했고, 2주 차에는 세포주기정지 인자인Cdkn1a의 감소와 Myc의 지속적인 증가와 Bax/Bcl의 감소가 나타났다. 각기 다른 FBS 처리농도에서 배양된 Myoblast derived cells을 동일한 Myotube유도 배양액에서 2주간 분화하였다. 대조군과 비교하여 20% FBS군은 Myod1, Myog, Myf6, Myh1의 유의적 증가가 1주부터 확인되었다. 결론적으로 혈청 대체 물질은 근육세포 배양액에서 혈청의 효과를 완벽히 모사할 수 없음이 증명되었고, 따라서 체외에서 상업적 목적의 근육 세포 대량 증식 및 분화를 위해서는 적절한 혈청 대체물 개발이 선행돼야 할 것으로 사료된다.
This study was performed to examine whether serum used for growth of skeletal muscle cells in vitro can be replaced by serum substitutes or not. Briefly, It was used commercial Promo cell growth medium with serum replacements (5% FBS) as a basal growth medium (GM). Mouse skeletal muscle cells were isolated from hind limb by Pre-plating (pp) technology. The isolated cells at pp 4 stage showed small and round morphology with refractive looks like myoblast/satellite like cells, and showed increase of Pax3/7, Myf5, Myod1 and Myog expression compared to fibroblasts. The cells were then named as myoblast derived cells (MDCs), and were used for the further experiments. MDCs were cultured into GM supplemented with 5, 10 or 20% FBS for 2 weeks. The total cells number were calculated after every 2 days using a hemocytometer. The number of cells increased significantly in 20% FBS cultured cells as compared to control (≥6 days) and was positively correlated with FBS concentration. Proliferation and apoptosis related genes were analyzed by real time PCR. It was shown the upregulation of Myc expression and downregulation of Bax by 20% FBS treatment at 1 week. Furthermore, there was reduction of Cdkn1a/ Bax/Bcl2 and increase of Myc expression at 2 weeks in 20% FBS cultured cells compared to control. The MDCs were differentiated with Promocell differentiation media (serum free) for 2 weeks, where 20% FBS compared to control showed significantly increased in expression of Myod1/Myog/Myf6/ Myh1 from 1 to 2 weeks. In conclusion, serum substitutes could not fully mimic the properties of the serum in the muscle cell culture. Therefore, for mass production of muscle cells for commercial purposes, it is necessary to develop the suitable serum to overcome cost and the ethical implications of extracting FBS.
Abstract
서론
재료 및 방법
1. 시약 및 배양액
2. 공시 재료
3. 근육세포의 분리 및 배양
4. 세포의 성장 곡선 확인
5. 면역 형광 염색
6. 근육세포의 체외 분화
7. Real time PCR을 이용한 유전자량 발현 분석
8. 통계분석
결과 및 고찰
1. 세포들의 형태학적 특징 분석
2. 정량 PCR에 의한 reference genes의 검증
3. Myogenesis 관련 유전자의 발현
4. 혈청 농도에 따른 Myoblast derived cells의 체외 증식능력 분석
5. 혈청의 농도에 따른 Myoblast derived cells의 증식 관련유전자 들의 발현
6. 혈청 농도에 의존적으로 배양된 Myoblast derived cells의Myotube/Myofiber 분화 및 유전자 발현
References
