논문 상세보기
pp.307-317
분별 원심분리와 자당, percoll 밀도구배를 이용하여 목본식물인 Archicitrus와 Metacitrus잎으로부터 mtDNA 분리법을 확립하였으며, 제한효소에 의한 분절양상을 살펴보았다. 3단계의 비연속 percoll 밀도구배 원심분리에 의해 21%와, 45%의 경계면으로부터 미토콘드리아를 분리하여 정제한 mtDNA의 순도는 분별 원심분리나 자당밀도구배 원심분리에 비해 훨씬 높았으며 EtBr/CsCl 밀도구배 원심분리에 의해 분리된 mtDNA는 원심분리 튜브의 중간부위에 단일밴드로 형성되었다. 또한 성엽과 신엽으로부터 분리한 mtDNA 수율은 성엽(0.5∼1㎍/200g)에 비해 신엽 (2㎍/200g)이 약 2배 더 높게 나타남을 알 수 있었다. Eco RⅠ에 의해 나타난 총 mtDNA의 분절 양상은 약 30개였으며 4종의 Archicitrus와 Metacitrus 모두 6.5Kb와 4.3Kb 사이에서 뚜렷한 분절 밴드를 나타냈으나 그 외의 분절양상은 거의 유사하게 보여졌다. Hind Ⅲ로 처리된 총 mtDNA의 분절 양상도 Eco RⅠ의 경우처럼 약 30개였으며 분자량이 큰 DNA 분절들이 뚜렷한 양상으로 나타났으나 Eco RⅠ의 분절양상과는 달리 Archicitrus와 Metacitrus에서 각기 5개(5.5, 4.4, 4.0, 2.3, 1.5Kb), 4개(5.0, 2.4, 2.15, 2.0Kb)의 특이한 밴드들이 나타났다. Pst Ⅰ에 의해 나타난 총 mtDNA의 분절 양상은 40여개였고 C. iyo Tanaka에는 결여된 6.0, 5.0, 2.8Kb 분절이 C. junos Sieb에 특이하게 나타났다. 이상과 같이 4종의 감귤속으로부터 분리한 mtDNA를 세 종류의 제한효소로 분석한 결과 Archicitrus와 Metacitrus사이에 상당한 차이를 보여 주었으며 각 아속내의 종 사이에는 거의 유사한 양상으로 나타남을 알수 있었으며 이는 감귤속의 유전적 특성과 세포질 게놈으로 존재하는 mtDNA의 특성에 따라 감귤속을 분류하는 데 토대가 되리라 사료된다.
The purity of mtDNAs isolated from Archicitrus and Metacitrus leaves was higher in percoll density gradient centrifugation than differential and sucrose density gradient centrifugation. The most clear mtDNAs were obtained from mitochondria included in the interface band of between 21% and 45% under isomotic, low viscosity conditions in the three step discontinuous percoll density gradient centrifugation. DNase treatment to the crude mitochondrial suspension still more increased purity of mtDNA by the effective removal of the nuclear and chloroplast DNA and mtDNAs were appeared as a single band at middle position of tube by EtBr/CsCl density gradient centrifugation. Agarose gel electrophoresis of mtDNAs resolved a single, broad band containing high molecular weight DNAs in all preparation. Yield of mtDNAs was about 1 ㎍ and 2 ㎍ per 200g in mature and immature leaves respectively. The mtDNA fragment patterns showed by EcoR Ⅰ treatment were indistinguishable with respect to number and position of bands in Archicitrus and Metacitrus. In the pattern of Hind Ⅲ restriction, the Metacitrus displayed the unique band between 5.0 and 4.0kb, in addition to four fragments about 5.0, 2.4, 2.15, and 2.0kb, respectively, different from Archicitrus. Also the pattern of total mtDNAs fragment by the treatment of Pst Ⅰ showed that the distinguishable fragment pattern was not appeared in Archicitrus(C. iyo Tanaka), but about 6.0, 5.5, 5.0 and 2.8kb fragments were appeared only in Metacitrus(C. junos Sieb). Therefore it was indicated that two species in intra-subgenus were identical each other, whereas considerable difference was revealed for inter-subgenus.
