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pp.26-36
Somatic cell nuclear transfer (SCNT) in pig embryos constitutes an essential technique used to provide pharmacological proteins, xenotransplantation organs, and animal models for disease research. Following the first successful heart transplantation involving transgenic pigs, stabilization has emerged as the primary objective for subsequent investigations. The attainment of successful transformations fundamentally hinges upon the production of high quality SCNT embryos. Nonetheless, the efficiency of SCNT embryo production in pigs and mini-pigs remains low. Enhancing the efficiency of SCNT embryos is contingent upon several crucial factors, among which the type of donor cells assumes paramount importance. In this study, continuous subculture was used to produce donor cells to establish optimal conditions for the subculture of porcine fetal fibroblasts. Furthermore, it is imperative to comprehensively understand cell characteristics according to morphology. Moreover, to address the complications arising from blood type disparities, we selected the OO type for examination. The blood type of the mini pig was subjected to analysis and classification using PCR techniques. Following the OO type selection, sgRNA(single guide RNA) was employed in conjunction with CRISPR-Cpf1 to knock-out the GGTA1 (a-1,3 galactosyl-transferase) gene, thereby eliciting an acute immune response. A minipig cell line devoid of the Gal(1,3)Gal epitope was consequently constructed. This constructed cell line was then cloned through SCNT, with the resultant cloned embryo being transplanted into a surrogate mother to yield a GGTA1 knock-out mini pig. These findings serve as fundamental data for future research endeavors on xenotransplantation and SCNT.
돼지의 체세포 핵이식(Somatic cell nuclear transfer,SCNT)은 인간에게 약리적 효과가 있는 단백질, 이종 간 장기이식(xenotransplantation)에 사용되는 장기, 질병 연 구 목적의 모델 동물을 제공한다. 특히 형질전환 돼지를 활용한 심장 이식이 세계 최초로 성공한 후 형질전환 돼 지 생산의 안정화는 다음 연구를 위한 중요한 점으로 대 두되고 있으나, 미니돼지의 체세포 핵이식 배아의 생산 효율은 아직 낮은 실정이다. 형질전환의 성공은 양질의 SCNT 배아 생산에서 시작되어야 한다. 이러한 SCNT 배 아의 생산 효율을 향상할 수 있는 요인 중에는 공여 세포 의 형태가 있으며, 성공적인 공여 세포의 생산을 위해서 는 종축에 따른 세포의 특성을 파악하여야 하고, 혈액형 의 차이에서 발생하는 문제점 해결을 위해 OO 타입의 선 별이 필요하다. 본 연구에서는 지속적인 계대 배양을 통 하여 공여 세포로 사용되는 미니돼지의 태아섬유아세포의 계대 배양 조건을 확립하고자 한다. 또한 미니돼지의 혈 액형을 PCR 기반으로 분석하여 분류하고 OO 타입의 선 별을 통하여 이종 간 이식에 용이하게 공여 세포의 조건 을 확립하였다. 이후 sgRNA(single guide RNA)를 사용하 여 CRISPR-Cpf1로 GGTA1(α-1,3 galactosyl-transferase) 유전자를 knock-out 한 미니돼지의 생산으로, 급성면역반 응을 유발하는 Gal(1,3)Gal epitope이 제거된 미니돼지의 세포 주를 구축 및 체세포 핵이식을 통해 GGTA1 knock-out 미니돼지를 생산하였으며, 이러한 연구는 이후 체세포 핵이식 및 이종 간 장기이식에 중요한 기초자료로 사용될 것이라고 생각된다.
Ⅰ. 서론
Ⅱ. 재료 및 방법
1. 시약
2. 동물실험윤리
3. 미니 돼지 섬유아세포 특성 분석 및 Primary 세포 주구축
4. 미니 돼지의 혈액형 분석
5. 미니 돼지 α-1,3 galactosyltransferase knock-out 세포주 구축
6. Magnetic separation(MK-0098)
7. 미니돼지 Knock out 복제란 및 산자 생산
8. 통계적 분석
Ⅲ. 결과
1. Mini-pig fetal fibroblast 특성 분석 및 primary 세포주 구축
2. 미니돼지의 혈액형 판별 분석
3. 미니 돼지 α-1,3 galactosyltransferase (GGTA1)knock-out 세포 주 구축
4. 미니돼지 knock-out 산자 생산
Ⅳ. 고찰
Ⅴ. 요약
사사
Ⅵ. 참고문헌
