BMP-2 is a well-known TGF-beta related growth factor, having a significant role in bone and cartilage formation. It has been employed to promote bone formation in some clinical trials, and to differentiate mesenchymal stem cells into osteoblasts. However, it is difficult to obtain this protein in its soluble and active form. hBMP-2 is expressed as an inclusion body in the bacterial system. To continuously supply hBMP-2 for research, we optimized the refolding of recombinant hBMP-2 expressed in E. coli, and established an efficient method by using detergent and alkali. Using a heparin column, the recombinant hBMP-2 was purified with the correct refolding. Although combinatorial refolding remarkably enhanced the solubility of the inclusion body, a higher yield of active dimer form of hBMP-2 was obtained from one-step refolding with detergent. The refolded recombinant hBMP-2 induced alkaline phosphatase activity in mouse myoblasts, at ED50 of 300-480ng/ml. Furthermore, the expressions of osteogenic markers were upregulated in hPDLSCs and hDPSCs. Therefore, using the process described in this study, the refolded hBMP-2 might be cost-effectively useful for various differentiation experiments in a laboratory.

Bone morphogenetic protein (BMP) 2 is a potent osteogenic factor. Although both Smad1/5 and mitogenactivated protein kinases (MAPKs) are activated by BMP2, the hierarchical relationship between them is unclear. In this study, we examined if BMP2-stimulated MAPK activation is regulated by Smad1/5 or vice versa. When C2C12 cells were treated with BMP2, the activation of extracellular signal-regulated kinase (ERK), p38 MAPK and c-Jun-N-terminal kinase was evident within 5 min. The knockdown of both Smad1 and Smad5 by small interfering RNA did not affect the activation of these MAPKs. In addition, neither the overexpression of Smad1 nor Smad5 induced ERK activation. When ERK activation was induced by constitutively active MEK1 expression, the protein level and activation of Smad1 increased. Furthermore, the inhibition of constitutively active BMP receptor type IB-induced ERK activation significantly suppressed Smad1 activation. These results indicate that Smad1/5 activation is not necessary for BMP2-induced MAPK activation and also that ERK positively regulates Smad1 activation.

We hypothesized that plaque-associated bacteria may have a role in maintenance of alveolar bone. To test it, immortalized gingival epithelial HOK-16B cells were co-cultured with live or lysed eight plaque bacterial species and the expression levels of bone morphogenetic protein (BMP)-2 and -4 were examined by real time reverse transcription-polymerase chain reaction. Un-stimulated HOK-16B cells expressed both BMP-2 and -4. Co-culture with plaque bacterial lysates had significant effects on the level of BMP-2 but not on that of BMP-4. Five species including Streptococcus sanguinis, S. gordonii, Veillonella atypica, Porphyromonas gingivalis, and Treponema denticola substantially up-regulated the level of BMP-2. In contrary to the upregulatory effect of lysate, live T. denticola suppressed the expression of BMP-2. In addition, in vitro osteoblastic differentiation assay using C2C12 cells and the conditioned medium of HOK-16B cells confirmed the production of BMPs by gingival epithelial cells and the modulation of BMP expression by the lysates of S. sanguinis and T. denticola. In conclusion, we have shown that plaque bacteria can regulate the expression of BMP-2 by gingival epithelial cells, the physiologic meaning of which needs further investigation.

골 형성 단백질(Bone morphogenetic protein, BMP)은 TGF-β superfamily의 구성원 중에 하나이며, 이들은 원래 뼈 형성을 유도하는 능력에 의해 발견되었지만, 뼈 외에도 다른 세포 및 기관의 성장과 분화를 조절하는 것으로 밝혀졌다. 다기능적인 골 형성 단백질은 포유동물의 reproduction에도 매우 중요한 역할을 하는데, 예를 들어 BMP8A와 BMP8B는 생쥐의 정자 형성과 부고환에 일정한 기능을 하는 것으로 보고되었고 난소에서의 BMP15는 난포성장을 자극하고, 과립막세포(granulosa cell)의 증식시키는데 관여하는 단백질로 알려져 있다. 하지만 난관(oviduct)에서의 BMP 역할은 알려진 바가 적다. 그래서 본 연구에서는 골 형성 단백질이 착상 전 oviductal environment에 어떠한 영향을 미치는지 밝히고자 하였다. 8주령 생쥐의 Estrous cyclic oviduct을 가지고 RT-PCR과 Immunohistochemistry(IHC)를 통해 BMP2, 4의 mRNA와 단백질 발현을 확인하였다. Estrogen에 의한 BMP2, 4의 영향을 확인하고자 난소절제술을 시행한 생쥐와 Estrogen receptor alpha(ERα) Knockout 생쥐를 통해 mRNA와 단백질 발현을 확인하였다. Oviduct의 ciliated cell을 가지고 BMP2, 4의 기능을 밝히고자 siRNA실험을 진행 하였다. Estrous cyclic oviduct cDNA를 통해 RT-PCR한 결과, 이 중 Estrus 시기에 가장 높은 발현을 보인 BMP2, 4의 mRNA level은 Isthmus보다 Infundibulum과 Ampulla에 증가하였고, Immunohistochemistry (IHC)를 통해 BMP2와 BMP4 단백질은 난관 상피세포 중에서 ciliated cell에 발현되었다. 이를 ciliated cell marker인 β-tubulin과 함께 Immunofluorescence(IF)를 진행한 결과, 주로 β-tubulin-positive ciliated cell에서 발현됨을 확인하였다. 난소 절제술을 시행한 생쥐의 난관에서는 E2와 DPN (ERβ agonist)에 의해 BMP2, 4 mRNA 발현이 증가하고, ERαKO 난관의 경우 WT(Die)에 비해 BMP2, 4 mRNA, 단백질의 발현 모두 증가하였다. BMP2와 BMP4의 기능을 밝히고자 Ciliated cell line인 OA-6b를 가지고 siRNA 실험을 진행한 결과, Bmp2, Bmp4 siRNA 처리군에서 Ciliated cell marker인 FOXJ1의 발현이 줄어들고 Proliferation marker인 Ki67, Pcna의 발현이 낮아졌다. 이로써, Oviduct 내 BMP2와 BMP4 발현은 Estrogen과 양의 상관성이 있으며, Ciliated cell에서 Estrogen - ER β signaling을 통해 조절된다. Estrogen에 의해 유도되는 BMP2와 BMP4는 ciliated cell에서 Autocrine, Paracrine factor로 작용할 가능성이 있다. 더 나아가 Oviduct의 Infundibulum 및 Ampulla에 강하게 발현되는 BMP2, BMP4는 난자 및 배아에 autocrine, paracrine factor로 작용하여 oviductal cell proliferation을 조절하고, 수정을 위한 oviductal environment 조성에 중요한 역할을 하는 것으로 사료된다.

골 형성 단백질(Bone morphogenetic protein, BMP)은 TGF-β superfamily의 구성원 중에 하나이며, 이 들은 원래 뼈 형성을 유도하는 능력에 의해 발견되었지만, 곧 세포분열, 세포자살, 세포이동 그리고 세포 분화를 조절하는 것으로 밝혀졌다. 매우 다기능적인 골 형성 단백질은 포유동물의 reproduction에도 매우 중요한 역할을 하지만 알려진 바가 적다. 그래서 본 연구에서는 골 형성 단백질이 착상 전 oviductal environment에 어떠한 영향을 미치는지 밝히고자 하였다. 먼저, Estrus 시기 생쥐의 oviduct cDNA를 통해 RT-PCR한 결과, BMP1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 15 mRNA와 BMP receptor인 BMPR1A, BMPR1B, BMPR2 mRNA의 발현을 확인하였고, BMP Inhibitor인 Noggin, Follistatin, Chordin mRNA의 발현 또한 확인하였다. 이들 중 BMP2, 3, 7, 15 mRNA의 level이 BMP5, 6, 10 mRNA의 level보다 많은 발현량을 보였다. BMP receptor 중에서는 BMPR2 mRNA의 level이 제일 높았다. BMP Inhibitor 중에서는 Chordin mRNA의 발현량이 제일 많았다. 이들 가운데 가장 높은 발현 수준을 보인 BMP2의 단백질의 localization은 Immunohistochemistry를 통해 확인하였다. BMP receptor와 BMP Inhibitor에 대한 연구는 진행 중에 있지만, 생식주기별 생쥐의 oviduct 내에서 BMP2 단백질의 발현수준은 proestrous, metestrous, diestrous보다 estrous stage에서 가장 강한 발현을 보였다. 이는 BMP2가 steroidogenesis에 영향을 주어 oviductal cell proliferation에 관여한다는 것을 보여준다.