폴리드나바이러스의 일종인 CpBV (Cotesia plutellae bracovirus) 바이러스 게놈에 포함된 시스타틴(CpBV-CST1) 유전자의 과발현이 곤 충의 면역 및 발육을 교란한다. 이 연구는 바이러스 유래 시스타틴의 생물적 기능의 심화 연구와 해충저항성 작물 개발을 위해 담배형질전환체를 구축하는 데 목적을 두었다. 이를 위해 형질전환체를 대상으로 목표유전자의 발현분석과 곤충에 대한 발육억제에 대한 생물검정을 수행했다. 시 스타틴 유전자를 pBI121 운반체에 재조합한 pBI121-CST를 제작하고, 이를 아그로박테리움(Agrobacterium tumefasciens) 세균 매개에 의한 담 배 형질전환 및 재분화를 유도하여 약 92%의 높은 신초 재분화율을 나타냈다. 이들 재분화된 개체 가운데 담배 genomic DNA에 시스타틴 유전 자가 삽입된 형질전환 추정 개체를 PCR 분석법으로 선발하였다. 다시 quantitative real-time PCR (qRT-PCR) 분석을 통해 이들 목표유전자 의 발현을 분석하였다. qRT-PCR 결과는 형질전환 추정 개체가 비형질전환체에 비해 유전자 발현이 약 17 배 높게 나타나 형질전환계통에서 목 표유전자가 안정적으로 발현되고 있음을 확인했다. 선발된 형질전환담배를 대상으로 갓 부화한 담배나방(Helicoverpa assulta) 1령 유충에 대한 살충효과를 확인하였다. 살충력에 있어서 형질전환계통간의 차이가 있었다. 특히 T9와 T12계통은 섭식 후 7 일차 조사에서 95% 이상의 살충효 과를 보였다. 이상의 결과들은 CpBV-CST1이 해충저항성 작물 개발에 필요한 유용 유전자 자원으로서 활용될 수 있음을 제시하고 있다.

시스타틴(cystatin: CST)은 C1A류 시스테인 단백질분해효소에 대한 경쟁적 가역억제자로서 동식물류에서 파파인과 같은 캐셉신을 억제 대상으로 작용하게 된다. 바이러스 유래 CST (CpBV-CST1)이 폴리드나바이러스의 일종인 CpBV (Cotesia plutellae bracovirus)에서 동정되었 다. 기존 연구는 이 유전자의 과발현이 배추좀나방(Plutella xylostella) 유충의 면역 및 발육을 교란한다는 것을 보여 주었다. 본 연구는 이 유전자 의 단백질 기능을 분석하기 위해 세균발현시스템을 이용하여 재조합단백질(rCpBV-CST1)을 형성하여 단백질분해효소에 대한 활성억제효과를 결정하고, 곤충의 면역과 발육에 대한 생리적 억제효과를 분석했다. 이 유전자 번역부위는 138 개 아미노산으로 약 15 kDa 크기의 단백질로 추 정되었다. CpBV-CST1이 먼저 pGEX 발현벡터에 재조합되고, BL21 STAR (DE3) competent cells에 형질전환된 후 0.5 mM IPTG로 4 시 간동안 과발현되었다. 분리된 재조합단백질은 파파인에 대한 뚜렷한 억제효과를 나타냈다. 이 재조합단백질은 파밤나방(Spodoptera exigua)에 대 해서 혈구소낭형성의 세포성 면역반응을 억제하고, 경구로 처리할 때 배추좀나방의 유충발육을 처리 농도에 비례하여 제한시켰다. 이상의 결과 는 CpBV-CST1이 해충 밀도 억제에 응용될 수 있음을 제시하고 있다.

Cystatins (CSTs) are reversible and competitive inhibitors of C1A cysteine proteases, corresponding to papain-like cathepsins in plants and animals. A viral CST (CpBV-CST1) was identified from a polydnavirus, Cotesia plutellae bracovirus. Our previous study indicated that overexpression of CpBV-CST1 interfered with immune response and development of Plutella xylostella larvae. This study produced a recombinant CpBV-CST1 protein (rCpBV-CST1) using bacterial expression system to analyze its inhibitory activity against cysteine protease and physiological role in the parasitism of an endoparsitoid wasp, Cotesia plutellae. The open reading frame (ORF) of CpBV-CST1 encodes a polypeptide of 138 amino acids (15 kDa). rCpBV-cystatin protein in BL21 STAR (DE3) competent cells containing a recombinant pGEX4T-3:CpBV-CST1 was overexpressed by 0.5 mM IPTG for 4 h. In biological activity assay, partially purified GST-fused rCpBV-CST1 showed inhibitory activity against papain. It also inhibited larval development of P. xylostella in a dose-dependent manner. These results suggest that CpBV-CST1 plays a role in retardation of larval development of P. xylostella during parasitism.

프루텔고치벌(Cotesia plutellae)은 내부기생봉으로 배추좀나방(Plutella xylostella) 의 어린 유충을 기생시켜 치사에 이르게 한다. 이 고치벌에 공생하는 폴리드나바이 러스인 C. plutellae bracovirus (CpBV)는 156개의 유전자를 갖고 피기생 기주의 생리를 교란하게 된다. 본 연구는 이 바이러스가 갖는 유전자들 가운데 cystatin에 대해서 유전자 염기서열 분석 및 발현 패턴과 생리적 기능을 탐구했다. CpBV는 3 개의 cystatin을 갖으며, 이를 각각 CpBV-CST1, CpBV-CST2, CpBV-CST3로 명 명하였다. 이들 ORF의 염기서열을 바탕으로 추정된 아미노산 서열은 다른 폴리드 나바이러스 cystatin과 높은 상동성을 보였다. 이들 유전자들의 발현을 분석한 결과 CpBV-CST1과 CpBV-CST3는 기생된 기주에서 발현되나, CpBV-CST2는 발현 되지 않아 pseudogene으로 판명되었다. CpBV-CST3는 피기생체에 특이적인 반 면, CpBV-CST1은 비기생 기주에서도 발현되었으며, 이 배추좀나방 유래 cystatin PCR 결과물(Px-CST1)을 염기서열 분석한 결과 CpBV-CST1의 ORF 서열과 100% 일치하였다. Px-CST1은 배추좀나방 전체 발육 기간 중에 발현되나, 조직적 으로 보면, 중장과 표피에서 주로 발현하였다. 반면에 피기생 기주에서 이 유전자 가 혈구 조직에서도 추가로 발현되는 현상을 나타났다. 이는 CpBV-CST1이 혈구 에 특이적으로 발현을 보이는 것으로 해석되었다. CpBV-CST3는 기생 전체 기간 발현되었고, 지방체, 혈구, 소화관 및 표피에서 발현되었다. CpBV-CST1을 진핵생 명체 발현벡터에 클로닝하여 transient expression을 유도한 결과 처리된 유충의 면 역이 크게 둔화되고, 발육이 지연되는 생리적 교란을 유발하였다. 본 연구 결과는 바이러스 유래 cystatin 유전자가 배추좀나방의 곤충생리인자로 작용한다는 것을 제시하고 있다.