In our previous studies, the cardiac xenotransplantation from an alpha-1,3-galactosyltransferase knockout pig (GT-MCP-MCP) to cynomolgus monkeys showed a mean survival of 38 days. The objective of this study is to genetically upgrade the GT-MCP-MCP pig, to further enhance membrane cofactor protein (MCP) expression and to express an endothelial specific thrombomodulin (TBM). MCP is a complement regulatory protein and TBM is a coagulation inhibitor. As the dicistronic cassette for wild-type-based MCP and TBM concurrent expressions does not show any increase of MCP, we optimized the MCP codon usage (mMCP) and substituted mMCP for MCP. When the mMCP-TBM cassette was transfected to HeLa cells, we were able to find an increased expression of MCP and endothelial cell-specific TBM expression. The cassette was then transfected into ear-skin fibroblasts isolated from one-month-old #23-4 of a GT-MCP-MCP pig, and the cell populations expressing MCP were obtained by MACS cell sorting. We performed a single cell culture of the selected cells, and obtained clones over expressing 90% MCP. The cells of a clone were used as a donor for nuclear transfer and generated GT-MCP/-MCP/mMCP/TBM pig. The transgenic pig was confirmed to be carrying the cells expressing MCP and functioning as an inhibitor against the cytotoxic effect of normal monkey serum, comparable with donor cells. Thus, we believe that the GT-MCP/-MCP/mMCP/TBM transgenic pig would be potential for the prolongation of xenograft survival in the recipients.

이종이식 시 사람과 돼지는 면역학 적으로 일치하지 않으므로, 면역세포의 활성화 및 조직의 병변 등을 유발한다. 특히, 영장류에는 존재하지 않고 돼지의 전 조직에서 발현되는 alpha-gal 인자에 의해, 이종이식 시 alpha-gal 항원에 대한 항체의 급격한 증가로 거부반응이 유발되며 영장류를 사망에 이르게 한다. 이에, 본 연구는 alpha-gal 합성에 관여하는 효소인 alpha-galactosyltransferase를 knock out(Gal-/-)한 돼지의 세포를 기반으로, 보체의 활성을 조절하는 membrane cofactor protein(MCP)과 혈액 응고를 저해하는 thrombomodulin(TBM)의 과발현을 유도하고자 하였다. 이는, 이종이식 시 발생하는 염증반응과 혈액응고 현상을 억제하는 복합형질 전환 돼지를 개발함으로 이종이식 후의 생존성 향상에 기여하고자 하였다. 따라서 codon modification 을 통해 염기서열을 변형한 MCP cDNA 는 CAG 프로모터를 이용하여 전 조직에서 발현되도록 하였고, TBM 은 Icam2 프로모터를 통해 혈관 내피세포 특이적인 발현을 유도하였다. 제작된 벡터를 Gal-/- 돼지의 섬유아세포에 도입하고 MCP 발현 수준이 높은 세포를 선별하여 세포주를 구축하였다. 구축된 체세포를 이용하여 체세포 복제란을 생산하고 외과적 방법으로 수란 돈에 이식하였다. 체외성숙(78%) 한 난자를 복제 및 융합(58%)한 후 4 두의 대리모에 각각 약 310 개의 복제란을 이식하였다. 대리모 1 두에서 임신(25%) 및 분만(25%)에 성공하였으며, 9 두의 산자 중 6 두가 생존하고 3 두는 사망하였다. 본 연구에서 생산된 TBM 유전자가 도입된 형질전환 복제돼지는 증식과정을 통해 축군을 조성하고 향후 영장류를 활용한 이종이식 연구에 활용될 예정이다.