In general, cloned pigs have been produced using the somatic cell nuclear transfer (SCNT) technique with various types of somatic cells; however, the SCNT technique has disadvantages not only in its low efficiency but also in the development of abnormal clones. This study aimed to compare early embryonic development and quality of SCNT embryos with those of induced pluripotent stem cells (iPSCs) NT embryos (iPSC-NTs). Ear fibroblast cells were used as donor cells and iPSCs were generated from these cells by lentiviral transduction with human six factors (Oct4, Sox2, c-Myc, Nanog, Klf4 and Lin28). Blastocyst formation rate in iPSC-NT (23/258, 8.9%) was significantly lower than that in SCNT (46/175, 26.3%; p < 0.05). Total cell number in blastocysts was similar between two groups, but blastocysts in iPSC-NT had a lower number of apoptotic cells than in SCNT (2.0 ± 0.6 vs. 9.8 ± 2.9, p < 0.05). Quantitative PCR data showed that apoptosis-related genes (bax, caspase-3, and caspase-9) were highly expressed in SCNT than iPSC-NT (p < 0.05). Although an early development rate was low in iPSC-NT, the quality of cloned embryos from porcine iPSC was higher than that of embryos from somatic cells. Therefore, porcine iPSCs could be used as a preferable cell source to create a clone or transgenic animals by using the NT technique.

Tumor necrosis factor receptor associated factor 4 (TRAF4)는 TNF receptor associated factor 군의 하나로 암세포 전이, 활성산소 생성, 세포극성에 관여한다. 쥐 배아발생의 8.5 에서 13.5 days post-coitum 시기에 TRAF4 의 발현이 높게 관찰된다. 세포 특성의 변화를 보이는 상피간엽이행(EMT)시에 TRAF4 가 세포막의 세포밀접에 위치하는 것으로 알려져 세포분화가 시작되는 배 발생 시에도 주요한 역할을 할 것으로 여겨진다. 하지만 돼지에서는 TRAF4 의 기능과 특성에 대한 연구가 미비하다. 본 연구는 돼지 TRAF4 의 mRNA 전장서열과 조직에서의 발현을 확인함으로써 TRAF4 의 특성에 대한 정보를 제공할 것이다. TRAF4 mRNA 의 전장 서열을 밝히기 위해서 돼지 신장유래세포(pK15)에서 total RNA 를 추출하여 RACE(Rapid Amplification of cDNA ends) PCR 이 수행되었다. 이 후 클로닝을 통해 얻은 암호영역, 5`UTR, 3`UTR 의 서열로 2,030 염기쌍의 mRNA 전장서열을 확인하였다. 조직에서 TRAF4 의 발현은 qPCR 로 상대정량되었다. 돼지 TRAF4 는 470 개의 아미노산을 지정하는데 이는 사람과는 8 개, 쥐와는 12 개 차이를 보였다. TRAF4 단백질의 TRAF 도메인은 다른 TRAF 군과 다르게 GTWRGS 의 고리를 가지는데 돼지에서도 동일한 서열이 확인되었다. 돼지에서 TRAF4 는 난소와 위에서 상대적으로 높은 발현을 보였다. TRAF4 의 mRNA 서열은 돼지의 TRAF4 에 대한 기초정보가 될것으로 여겨진다.

조직 플라스미노겐 활성제(Tissu-type plasminogen activator; tPA)는 혈전 용해제로 이용되고 있으며, 주로 심근경색증과 같은 급성 혈전후성 허혈증 등을 치료하는 데 유용하다. 본 연구에서는 혈관 질환 치료제를 생산하기 위하여 체세포 복제를 이용한 htPA 를 발현하는 형질전환 복제 돼지를 생산하였다. 형질전환 복제란 8,026 개를 25 두의 대리모에(321 개/1 두) 이식하였으며, 25 두 중 6 두의(24%) 대리모가 자연분만으로 19 두의(3.2 두/1 두) 산자를 생산하였다. 19 두 중 1 두가(1/19 두, 5.3%) 생존 중에 있으며, 8 두는 사산 개체였고(8/19 두, 42.1%), 10 두는 출생 후 2-3 일내에 폐사하였다(10/19 두, 52.6%). 폐사 개체들은 혀 기형, 구개열 등 안면기형이 관찰되었으며, 이와 함께 관절 혹은 발굽의 모양이 비정상적이라는 것을 확인하였다. 또한, 폐사개체들은 모두 하나 이상의 문제점을 동시에 가지고 있음을 확인하였다. 따라서, 이러한 문제점들이 형질전환에 의한 것인지, 아니면 복제에 의한 것인지를 규명하기 위해 연구를 더 진행해야 할 것으로 사료된다.조직 플라스미노겐 활성제(Tissu-type plasminogen activator; tPA)는 혈전 용해제로 이용되고 있으며, 주로 심근경색증과 같은 급성 혈전후성 허혈증 등을 치료하는 데 유용하다. 본 연구에서는 혈관 질환 치료제를 생산하기 위하여 체세포 복제를 이용한 htPA 를 발현하는 형질전환 복제 돼지를 생산하였다. 형질전환 복제란 8,026 개를 25 두의 대리모에(321 개/1 두) 이식하였으며, 25 두 중 6 두의(24%) 대리모가 자연분만으로 19 두의(3.2 두/1 두) 산자를 생산하였다. 19 두 중 1 두가(1/19 두, 5.3%) 생존 중에 있으며, 8 두는 사산 개체였고(8/19 두, 42.1%), 10 두는 출생 후 2-3 일내에 폐사하였다(10/19 두, 52.6%). 폐사 개체들은 혀 기형, 구개열 등 안면기형이 관찰되었으며, 이와 함께 관절 혹은 발굽의 모양이 비정상적이라는 것을 확인하였다. 또한, 폐사 개체들은 모두 하나 이상의 문제점을 동시에 가지고 있음을 확인하였다. 따라서, 이러한 문제점들이 형질전환에 의한 것인지, 아니면 복제에 의한 것인지를 규명하기 위해 연구를 더 진행해야 할 것으로 사료된다.

이종이식 시 사람과 돼지는 면역학 적으로 일치하지 않으므로, 면역세포의 활성화 및 조직의 병변 등을 유발한다. 특히, 영장류에는 존재하지 않고 돼지의 전 조직에서 발현되는 alpha-gal 인자에 의해, 이종이식 시 alpha-gal 항원에 대한 항체의 급격한 증가로 거부반응이 유발되며 영장류를 사망에 이르게 한다. 이에, 본 연구는 alpha-gal 합성에 관여하는 효소인 alpha-galactosyltransferase를 knock out(Gal-/-)한 돼지의 세포를 기반으로, 보체의 활성을 조절하는 membrane cofactor protein(MCP)과 혈액 응고를 저해하는 thrombomodulin(TBM)의 과발현을 유도하고자 하였다. 이는, 이종이식 시 발생하는 염증반응과 혈액응고 현상을 억제하는 복합형질 전환 돼지를 개발함으로 이종이식 후의 생존성 향상에 기여하고자 하였다. 따라서 codon modification 을 통해 염기서열을 변형한 MCP cDNA 는 CAG 프로모터를 이용하여 전 조직에서 발현되도록 하였고, TBM 은 Icam2 프로모터를 통해 혈관 내피세포 특이적인 발현을 유도하였다. 제작된 벡터를 Gal-/- 돼지의 섬유아세포에 도입하고 MCP 발현 수준이 높은 세포를 선별하여 세포주를 구축하였다. 구축된 체세포를 이용하여 체세포 복제란을 생산하고 외과적 방법으로 수란 돈에 이식하였다. 체외성숙(78%) 한 난자를 복제 및 융합(58%)한 후 4 두의 대리모에 각각 약 310 개의 복제란을 이식하였다. 대리모 1 두에서 임신(25%) 및 분만(25%)에 성공하였으며, 9 두의 산자 중 6 두가 생존하고 3 두는 사망하였다. 본 연구에서 생산된 TBM 유전자가 도입된 형질전환 복제돼지는 증식과정을 통해 축군을 조성하고 향후 영장류를 활용한 이종이식 연구에 활용될 예정이다.

Acute vascular rejection has been known as a main barrier occurring in a xenograted tissue of alpha 1,3-galactosyltransferase knock-out (GalT KO) pig into a non-human primate (NHP). Adenosine which is a final metabolite following sequential hydrolysis of nucleotide by ecto-nucleotidases such as CD39 and CD73, act as a regulator of coagulation, and inflammation. Thus xenotransplantation of CD39 and CD73 expressing pig under the GalT KO background could lead to enhanced survival of recipient NHP. We constructed a human CD39 and CD73 expression cassette designed for endothelial cell-specific expression using porcine Icam2 promoter (pIcam2-hCD39/hCD73). We performed isolation of endothelial cells (pAEC) from aorta of 4 week-old GalT KO and membrane cofactor protein expressing pig (GalT-MCP/-MCP). We were able to verify that isolated cells were endothelial-like cells using immunofluorescence staining analysis with von Willebrand factor antibody, which is well known as an endothelial maker, and tubal formation assay. To find optimal condition for efficient transfection into pAEC, we performed transfection with GFP expression vector using four programs of nucleofection, M-003, U-023, W-023 and Y-022. We were able find that the program W-023 was optimal for pAEC with regard to viability and transfection efficiency by flow cytometry and fluorescent microscopy analyses. Finally, we were able to obtain GalT-MCP/-MCP/CD39/CD73 pAEC expressing CD39 and CD73 at levels of 33.3% and 26.8%, respectively. We suggested that pACE isolated from GalT-MCP/-MCP pig might be provided as a basic resource to understand biochemical and molecular mechanisms of the rejections and as an alternative donor cells to generate GalT-MCP/-MCP/CD39/CD73 pig expressing CD39 and CD73 at endothelial cells.

체외 배양액에 성장호르몬 및 사이토카인의 첨가는 초기배 발육 및 생산된 배반포의 질에 영향을 미칠 수 있다. 본 연구는 돼지 유도만능줄기세포(porcine induced pluripotent stem cell, piPSC)의 조정배지(conditioned medium, CM)가 돼지 난자의 체외성숙 및 단위발생 후 초기배 발육에 미치는 영향을 검토하기 위하여 수행하였다. 난자-난구세포 복합체(cumulus-oocyte complex, COC)는 0(control), 25, or 50%의 줄기세포 배양액(stem cell medium, SM) 또는 CM이 첨가된 체외성숙 배양액으로 배양하였으며, 성숙된 난자는 활성화 유도 후 같은 농도의 SM 또는 CM을 첨가한 체외배양액에서 배양하였다. 체외 성숙율은 CM-25% 그룹에서 대조구보다 유의적으로 높았으나(p<0.05), 다른 SM 또는 CM 처리구와는 차이가 없었다. 배반포 형성율은 CM-25% 그룹(29.2%)에서 대조구(20.7%), SM-50%(19.6%) 및 CM-50%(23.66%) 처리구보다 유의적으로 높았다(p<0.05). 배반포에서의 세포수 및 세포사 비율은 SM-25% 그룹이 대조구에 비하여 유의적인 차이가 나타났다(p<0.05). 난자의 질과 연관되어 있는 유전자들(Oct4, Klf4, Tert 및 Zfp42)의 발현은 CM-25% 그룹에서 대조구보다 유의적으로 증가되었다(p<0.05). 따라서 본 실험의 결과 체외성숙(IVM) 및 체외발달(IVC) 배양액에 25% 수준의 CM의 첨가는 돼지 단위발생 난자의 배발달과 난자의 질적 향상에 기여하는 것으로 사료된다.