The identification of biomarkers of a living tissues is essentially required to understand specific functions of the cells. In previous study, we reported IGFBP 3 as one of the putative biomarkers, by showing specific expression at porcine spermatogonial stem cells (SSCs) of early stage of porcine testis. In this study, we analyzed the expression of seven members of IGFBP family (IGFBPs) in SSCs and histological expression pattern of pregnancy-associated plasma protein-A (PAPP-A), which plays a role on the growth promoting enzyme by cleavage of IGFBPs in testis of 5 days old pig. RT-PCR analysis showed that IGFBP 1, 2, 3, 4, and 6 were expressed at high level specifically in porcine SSCs compared with whole testis. We performed immunohisotochemical staining of testis sections with PAPP-A and protein gene product 9.5 (PGP9.5) which are the known biomarkers for SSCs. We were not able to find co-expression of PAPP-A and PGP9.5; PAPP-A was expressed only in Sertoli cells and PGP9.5 expression was confirmed in spermatogonium. Additionally, we were able to confirm the GATA4 expression in Sertoli and Leydig cells as a regulator of Sertoli cell function was not detected PGP9.5 expressing cells, indicating indirect evidence of that cytolocalization of PAPP-A expression is limited in Sertoli cells. These results suggested that the PAPP-A expressed in Sertoli cells may play role on regulation of development and differentiation of testicular cells through the IGF axis in neonatal porcine testis.

Acute vascular rejection has been known as a main barrier occurring in a xenograted tissue of alpha 1,3-galactosyltransferase knock-out (GalT KO) pig into a non-human primate (NHP). Adenosine which is a final metabolite following sequential hydrolysis of nucleotide by ecto-nucleotidases such as CD39 and CD73, act as a regulator of coagulation, and inflammation. Thus xenotransplantation of CD39 and CD73 expressing pig under the GalT KO background could lead to enhanced survival of recipient NHP. We constructed a human CD39 and CD73 expression cassette designed for endothelial cell-specific expression using porcine Icam2 promoter (pIcam2-hCD39/hCD73). We performed isolation of endothelial cells (pAEC) from aorta of 4 week-old GalT KO and membrane cofactor protein expressing pig (GalT-MCP/-MCP). We were able to verify that isolated cells were endothelial-like cells using immunofluorescence staining analysis with von Willebrand factor antibody, which is well known as an endothelial maker, and tubal formation assay. To find optimal condition for efficient transfection into pAEC, we performed transfection with GFP expression vector using four programs of nucleofection, M-003, U-023, W-023 and Y-022. We were able find that the program W-023 was optimal for pAEC with regard to viability and transfection efficiency by flow cytometry and fluorescent microscopy analyses. Finally, we were able to obtain GalT-MCP/-MCP/CD39/CD73 pAEC expressing CD39 and CD73 at levels of 33.3% and 26.8%, respectively. We suggested that pACE isolated from GalT-MCP/-MCP pig might be provided as a basic resource to understand biochemical and molecular mechanisms of the rejections and as an alternative donor cells to generate GalT-MCP/-MCP/CD39/CD73 pig expressing CD39 and CD73 at endothelial cells.

Pig has been known to be one of the most feasible animals as a bioreactor to produce pharmaceuticals in milk and as a mediator in xenotransplantation research. Previously, we generated transgenic pigs for both purposes, which were expressing Factor 8, vWF, hTPA, and hEPO in milk, along with expression of MCP at GalT gene locus (GalT-MCP/-MCP) as well as expressing MCP at GalT gene loci with CD73 expression (GalT-MCP/+/CD73). In this study, we performed comparative analyses of sperm parameters between wild type male (WT) pig and those transgenic males to examine the effects of transgenes integrated into the pigs on motility, morphology, viability, and acrosome integrity of the spermatozoa. Our results showed that the rates of actively motile spermatozoa of WT, Factor 8, vWF, hTPA, hEPO, GalT-MCP/+/CD73, and GalT-MCP/-MCP pigs were 85.0%, 83.3%, 82.5%, 83.3%, 82.5%, 77.5%, and 78.7%, respectively. Whereas, the rates of morphologically normal spermatozoa of WT, Factor 8, vWF, hTPA, hEPO, GalT-MCP/+/CD73, and GalT-MCP/-MCP pigs were 90.0%, 80.0%, 80.0%, 83.3%, 85.0%, 91.8%, and 80.8%, respectively. In addition, the viability in spermatozoa of WT, Factor 8, vWF, hTPA, hEPO, GalT-MCP/+/CD73, and GalT-MCP/-MCP pigs were 93.9%, 82.4%, 89.9%, 83.9%, 87.4%, 92.8%, and 83.6%, respectively. The rates of spermatozoa with normal acrosome integrity in WT, Factor 8, vWF, hTPA, hEPO, GalT-MCP/+/CD73, and GalT-MCP/-MCP pigs were 98.1%, 98.6%, 98.6%, 98.7%, 98.1%, 99.5%, and 95.1%, respectively. There were no significant differences in motility, morphology, viability, and acrosome integrity of the spermatozoa among WT, Factor 8, vWF, hTPA, and hEPO, GalT-MCP/+/CD73, and GalT-MCP/-MCP pigs. These mean that neither random integration nor targeted integration of the transgene into chromosome of pig effect on characteristics of spermatozoa. Ultimately, the transgenic male pigs subjected in this study could apply to propagate their progenies for production of human therapeutic proteins and advancing the xenotransplantation research.

Pigs have been extensively used as mediators of xenotransplantation research. Specifically, the Massachusetts General Hospital (MGH) miniature pig was developed to fix major histocompatibility antigens for use in xenotransplantation studies. We generated transgenic pigs for xenotransplantation using MGH pigs. However, it has not been studied yet whether these pigs show similarity of reproductive physiological characteristics to wild types of MGH miniature pig. In this study we analyzed the estrous cycles and pregnancy characteristics of wild type (WT) and transgenic MGH miniature pigs, which were α1,3-galactosyltransferase (GalT) heterozygous and homozygous knock-out, and membrane cofactor protein (MCP) inserted in its locus, GalT-MCP/+ and GalT-MCP/-MCP pigs. Estrous cycles of WT, GalT-MCP/+ and GalT-MCP/-MCP pigs were 20.9±0.74, 20.1±1.26, and 17.3±0.87 days, respectively, and periods of estrous were 3.2±0.10, 3.1±0.12, and 3.1±0.11 days. The periods of gestation of WT, GalT-MCP/+ and GalT-MCP/-MCP pigs were 114.2±0.37, 113.3±0.67, and 115.4±0.51 days, respectively. Litter sizes of WT, GalT-MCP/+ and GalT-MCP/-MCP pigs were 4.8±0.35, 4.8±1.11 and 3.0±0.32 respectively. There were no significant differences on estrous cycle, periods of estrous and gestation, and litter size among WT, GalT-MCP/+ and GalT-MCP/-MCP pigs, meaning that GalT knock-out and additional expression MCP of the MGH miniature pig did not effect on reproduction traits. These results provide relevant information to establish breeding system for MGH transgenic pig, and for propagation of GalT-MCP/-MCP pig to supply for xenotransplantation research.

Transplantation is considered to be a very useful approach to improve human welfare and to prolong life-span. Heterologous organ transplantation using pig organs which are similar to human beings and easy to make mass-production has known as one of the alternatives. To ensure potential usage of the pig organ for transplantation application, it is essentially required to generate transgenic pig modifying immuno-related genes. Previously, we reported production of heterozygous α 1,3-galactosyltransferase (GalT) knock-out and human membrane cofactor protein (MCP) expressing pig (GalT-MCP/+), which is enforced for suppression of hyperacute and acute immunological rejection. In this study, we reported generation of homozygous pig (GalT-MCP/-MCP) by crossbreeding GalT-MCP/+ pigs. Two female founders gave birth to six of GalT-MCP/-MCP, and seven GalT-MCP/+ pigs. We performed quantitative real-time PCR, western blot, and flow cytometry analyses to confirm GalT and MCP expression. We showed that fibroblasts of the GalT-MCP/-MCP pig do not express GalT and its product Gal antigen, while efficiently express MCP. We also showed no expression of GalT, otherwise expression of MCP at heart, kidney, liver and pancreas of transgenic pig. Taken together, we suggest that the GalT-MCP/-MCP pig is a useful candidate to apply xenotransplantation study.

돼지의 장기를 영장류에 이식할 때 단시간 내에 발생하는 초급성 면역거부반응 문제를 해결하기 위해 이를 제어할 수 있는 alpha1,3-galactosyltransferase knock out (Gal-T-/-) 돼지를 생산하였다. 그럼에도 불구하고 그 심장을 이식을 받은 영장류가 사망하는 것으로 보고되었으며, 그 원인은 non-Gal 항원-항체 반응에 의한 면역반응과 돼지와 영장류 간 분자, 생리적 차이에 의해 발생하는 급성 체액성 거부반응 때문이라고 알려져 있다. 본 연구는 어떤 인자와 기전에 의해 이식된 장기가 손상되고 사망하게 되는지 분자 수준에 서 알아보기 위하여, 영장류에 이식한 Gal-T-/- 돼지 심장에서 유전자의 발현 변화를 분 석하였다. 이를 위해 동일 부모에서 태어난 Gal-T-/- 돼지의 이식에 활용하지 않은 심장 을 대조군으로 하여 cynomolous 원숭이에 이식 후 9일째 채취한 심장으로부터 총 RNA 를 추출한 후 Sequencing을 통해 전 돼지 유전자의 발현수준을 비교하였다. 분석 결과, 이식된 심장에서 1292개의 유전자 발현이 유의적으로 증가하였고, 949개는 유의적으로 감 소하는 것으로 분석되었다. 이 중에서 심근 경색 등과 같이 심장이 손상되면 발현이 증가 하는 matricellular 단백질 유전자인 tenascin C(23.7배), Tsp-1(13.9배), -2(5.8배), -4(6.6 배), SPARC(3.6)의 발현이 증가한 것으로 분석되었다. 특히 혈관에서 혈액 응고를 촉진 시킨다고 알려진 Tsp-1의 발현이 유의하게 증가한다는 것을 quantitative RT-PCR 분석 으로 확인하였다. 또한 혈액응고의 중요한 조절 인자인 TF의 발현이 증가한 반면 억제 인자인 TFPI와 TBM의 발현은 변화가 없다는 것을 확인하였다. 이러한 결과는 이식 과 정 중에 가해진 생리적 또는 물리적 손상 및 원숭이 혈액의 재관류 자극에 의해 심장의 기능 마커 유전자가 지속적으로 발현되는 것으로 예측된다.

Nucleotide metabolism in endothelium is variable between different species. Recent studies demonstrated that this variability could contribute coagulation dysfunction, even though organs of the alpha 1,3-galactosyltransferase gene knockout pig were transplanted into the primate. CD73 (ecto-5'-nucelotidase) is an enzyme at cell surface catalyzing the hydrolysis of adenosine triphosphate to adenosine, which plays role on a substance for anti-inflammatory and anti-coagulant. Thus, overexpression of CD73 in endothelial cells of the pig is considered as an approach to reduce coagulopathy. In this study, we constructed a human CD73 expression vector under control of porcine Icam2 promoter (pIcam2-hCD73), which is expressed specifically at endothelial cells, and of CMV promoter as a control (CMV-CD73). First, we transfected the CMV-CD73 vector into HEK293 cells, and then confirmed CD73 expression at cell surface by flow cytometry analysis. Next, we transfected the pIcma2-CD73 and CMV-CD73 vectors into primary porcine fibroblasts and endothelial cells. Consequence was that the pIcma2-CD73 vector was expressed only at the porcine endothelial cells, meaning that the pIcam2 promoter lead to endothelial cell-specific expression of CD73 in vitro. Finally, we nucleofected the pIcam2-hCD73 vector into passage 3 fibroblasts, and enforced hygromycin selection of 400mg/ml. We were able to obtain forty three colonies harboring pIcam2-CD73 to provide donor cells for transgenic cloned porcine production.

혈액응고 제 8인자(FVIII)는 혈액 내 존재하는 당단백질의 하나로, 혈액응고의 내인성 기 작에 기능한다. 이러한 FVIII의 결핍은 A형 혈우병을 야기하는 것으로 알려져 있으며, A형 혈우병 환자는 FVIII의 지속적인 주사에 의해 치료되고 있다. 본 연구는 A형 혈우병의 치료 제로써 활용 가능한 B-domain이 변형된 재조합 인간 혈액응고 제 8인자 (dB747)를 유즙으 로 분비하는 형질전환 돼지의 유즙으로부터 크로마토그래피적인 방법으로 dB747의 효율 적 인 정제를 위한 방법을 제공하기 위하여 수행되었다. 연구는 dB747을 유즙으로 발현하는 형질전환 돼지의 유즙을 착유하여 원심분리를 통해 지질과 불순물을 제거하고, 유즙 내 복 합적으로 존재하는 수 많은 단백질을 분획하기 위한 전처리 과정으로써 일반적으로 유즙 단백질을 침전시킨다고 알려진 zinc chloride, calcium chloride와 일반적인 단백질 침전에 널리 이용되는 ammonium sulfate를 농도 별로 처리하여 분획의 정도를 확인하였다. 전처 리 과정을 통해 분획된 유즙을 이용하여 음이온 교환 크로마토그래피, 친화 크로마토그래피 방 법으로 정제하였다. 음이온 교환 크로마토그래피는 혈장 유래의 FVIII을 정제하는데 유리하 다고 알려진 Q sepharose FF 컬럼을 이용하여 대표적인 두 가지 sodium acetate와 sodium citrate buffer의 효과를 비교하였다. 또한, 친화 크로마토그래피는 B-domain이 결여된 재조합 인간 혈액응고 제 8인자(BDDrFVIII)을 정제하는데 이용 가능하다고 알려진 펩타이드 TN8.2와 EYHSWEYC를 리간드로 사용한 컬럼을 제작하여 수행하였다. 그 결과, dB747이 포함된 형질전환 돼지의 유즙을 분획하기 위해서는 ammonium sulfate의 연속적인 처리를 통해 포화도 30%의 상층액을 회수하여 포화도 50%가 되도록 ammonium sulfate를 첨가하 였을 때 생성되는 pellet을 이용하는 것이 가장 효율적인 것으로 나타났다. 효율적인 전처리 과정을 거친 유즙을 이용한 크로마토그래피 결과, 혈장 유래의 FVIII의 정제에 대한 이전의 보고와는 다르게 dB747의 회수율과 순도가 낮았다. EYHSWEYC를 이용한 친화 크로마토 그래피의 경우, 알려진 것과는 다르게 dB747과 결합하지 않는 것으로 확인되었으며, TN8.2 를 이용한 친화 크로마토그래피 역시 dB747를 정제하는데 이용하기 어려웠다. 또한, 크로 마토그래피 용출액 내에 20～40 kDa의 단백질이 나타나는 것을 확인하였으며, 이는 문헌 조사를 통해 카제인으로 유추할 수 있었다. 이러한 결과는 dB747이 B-domain 영역이 변형 되는 과정에서 기존의 FVIII 또는 BDDrFVIII과 단백질의 성질이 달라짐으로써 기존에 알려 진 정제 조건이 알맞지 않기 때문에 회수율과 순도가 낮았던 것으로 사료된다. 따라서 dB747의 성질을 이해하고 최적화된 크로마토그래피 조건을 확립하기 위한 연구가 필요할 것이다. 또한, 카제인과 같은 유즙 단백질이 크로마토그래피 용출액에서 나타나는 것으로 보아, 유즙 단백질은 음이온 교환 크로마토그래피나 친화 크로마토그래피에 의해 제거되지 않음을 확인할 수 있었다. 그러므로 초기 전처리 단계에서 유즙 단백질을 제거하기 위한 방 법의 연구가 유즙 내 목적 단백질을 정제하는데 있어서 중요한 문제가 될 것이다.

본 연구는 핵산가수분해 기능이 있는 항체인 3D8 scFv(single-chain variable fragment) 유전자를 형질전환 닭에서 발현시키고 3D8 scFv 항체의 항-바이러스 기능을 검증하고자 한다. 연구는 in vitro(형질전환 닭유래 세포)와 in vivo(형질전환 닭)로 나누어서 수행하고자 한다. 먼저 닭 태아섬유아세포는 형질전환 닭과 일반 닭을 각각 인공수정을 시킨 후 생산된 10일차 수정란의 태아에서 CEF(Chicken Embryo Fibroblast)를 수집하였다. 3D8 scFv 유전 자가 삽입된 CEF 세포는 항생제(puromycin)를 이용하여 형질전환 세포만을 선발하였다. 그 리고 선발된 CEF 세포는 면역염색을 이용하여 3D8 scFv 유전자가 세포내에서 단백질로 발현됨을 확인하였다. 그리고 선발된 세포들의 항-바이러스 기능 검증은 GFP 유전자로 표 지된 재조합 NDV(Newcastle Disease Virus)를 세포에 직접 감염시키고, 세포내에서 발현 하 는 GFP의 발현량을 FACS를 이용하여 정량하는 방법으로 항-바이러스 기능을 조사하였다. 이들 가운데 항-바이러스 기능이 있을 것으로 예상되는 형질전환 2계통에 대하여 항-바이러스 기능을 검증을 준비하고 있다.

돼지는 인간과 생리적으로 유사하기 때문에 다양한 목적으로 연구되고 있다. 최근에는 돼 지를 이용한 이종장기이식 관련 연구가 큰 주목 받고 있으며, 치료용 단백질을 생산하기 위 한 생체반응기로써 이용되고 있다. 이러한 연구에 있어서 당 사슬의 역할은 매우 중요하다. 당 사슬은 치료용 단백질의 체내 안정성에 큰 영향을 미치며 다양한 방법으로 면역을 조절 한다고 알려져 있다. 하지만 돼지에서의 당 사슬 관련 연구는 미비하며, 많은 당 전이효소 들의 서열이나 기능이 정확히 분석되지 않고 있다. 따라서 이번 연구에서는 당 전이효소 중 하나인 β‐1,3‐N‐acetylglucosaminyltransferase 1 (B3GNT1)을 돼지로부터 동정 후 PK‐15 세 포주를 이용하여 기능분석을 하였다. 이 유전자는 다양한 glycan epitope를 형성하는데 있 어서 중요한 기능을 한다. 먼저 간 조직으로부터 획득된 cDNA를 주형으로 degenerated PCR을 수행하여 유전자를 동정하였다. 동정된 유전자는 368개의 아미노산을 encoding하 는 1227개의 nucleotide로 구성되어 있으며, 다른 종에서 보고된 B3GNT1과 높은 상동성을 가 지고 있는 것을 확인하였다. 또한, 기능 분석을 위하여 돼지 신장세포인 PK‐15에서 B3- GNT1의 과 발현을 유도하였다. RT‐PCR과 Western blot을 통하여 유전자의 과발현을 확인 하고, Lycopersicon esculentum lectin (LEA)를 이용한 ELISA 분석 방법을 통해 효소의 기 능을 확인하였다. B3GNT1은 poly N‐acetylactosamine (polyLacNAc) 형성에 중요한 역할 을 하기 때문에 이를 특이적으로 인지하는 LEA를 사용하였다. 이를 통해 B3GNT1의 과발현이 유도된 세포에서 더 많은 polyLacNAc이 합성되었음을 확인할 수 있었다. 또한, Gal(β1‐ 3)GalNAc structure를 이용한 기질반응을 통해 효소의 기능을 확인하였다. 과발현이 유도 된 세포에서 약 3배 이상의 높은 기질 반응성을 보였으며, 이를 통해 돼지로부터 클로닝 된 B3GNT1의 기능을 확인할 수 있었다. 돼지로부터 당 전이효소를 동정하고 분석하는 연구는 생체반응기로써 돼지를 이용하는 다른 연구에 중요한 기반이 될 것이라고 생각한다