논문 상세보기
혈액응고 제 8인자(FVIII)는 혈액 내 존재하는 당단백질의 하나로, 혈액응고의 내인성 기 작에 기능한다. 이러한 FVIII의 결핍은 A형 혈우병을 야기하는 것으로 알려져 있으며, A형 혈우병 환자는 FVIII의 지속적인 주사에 의해 치료되고 있다. 본 연구는 A형 혈우병의 치료 제로써 활용 가능한 B-domain이 변형된 재조합 인간 혈액응고 제 8인자 (dB747)를 유즙으 로 분비하는 형질전환 돼지의 유즙으로부터 크로마토그래피적인 방법으로 dB747의 효율 적 인 정제를 위한 방법을 제공하기 위하여 수행되었다. 연구는 dB747을 유즙으로 발현하는 형질전환 돼지의 유즙을 착유하여 원심분리를 통해 지질과 불순물을 제거하고, 유즙 내 복 합적으로 존재하는 수 많은 단백질을 분획하기 위한 전처리 과정으로써 일반적으로 유즙 단백질을 침전시킨다고 알려진 zinc chloride, calcium chloride와 일반적인 단백질 침전에 널리 이용되는 ammonium sulfate를 농도 별로 처리하여 분획의 정도를 확인하였다. 전처 리 과정을 통해 분획된 유즙을 이용하여 음이온 교환 크로마토그래피, 친화 크로마토그래피 방 법으로 정제하였다. 음이온 교환 크로마토그래피는 혈장 유래의 FVIII을 정제하는데 유리하 다고 알려진 Q sepharose FF 컬럼을 이용하여 대표적인 두 가지 sodium acetate와 sodium citrate buffer의 효과를 비교하였다. 또한, 친화 크로마토그래피는 B-domain이 결여된 재조합 인간 혈액응고 제 8인자(BDDrFVIII)을 정제하는데 이용 가능하다고 알려진 펩타이드 TN8.2와 EYHSWEYC를 리간드로 사용한 컬럼을 제작하여 수행하였다. 그 결과, dB747이 포함된 형질전환 돼지의 유즙을 분획하기 위해서는 ammonium sulfate의 연속적인 처리를 통해 포화도 30%의 상층액을 회수하여 포화도 50%가 되도록 ammonium sulfate를 첨가하 였을 때 생성되는 pellet을 이용하는 것이 가장 효율적인 것으로 나타났다. 효율적인 전처리 과정을 거친 유즙을 이용한 크로마토그래피 결과, 혈장 유래의 FVIII의 정제에 대한 이전의 보고와는 다르게 dB747의 회수율과 순도가 낮았다. EYHSWEYC를 이용한 친화 크로마토 그래피의 경우, 알려진 것과는 다르게 dB747과 결합하지 않는 것으로 확인되었으며, TN8.2 를 이용한 친화 크로마토그래피 역시 dB747를 정제하는데 이용하기 어려웠다. 또한, 크로 마토그래피 용출액 내에 20～40 kDa의 단백질이 나타나는 것을 확인하였으며, 이는 문헌 조사를 통해 카제인으로 유추할 수 있었다. 이러한 결과는 dB747이 B-domain 영역이 변형 되는 과정에서 기존의 FVIII 또는 BDDrFVIII과 단백질의 성질이 달라짐으로써 기존에 알려 진 정제 조건이 알맞지 않기 때문에 회수율과 순도가 낮았던 것으로 사료된다. 따라서 dB747의 성질을 이해하고 최적화된 크로마토그래피 조건을 확립하기 위한 연구가 필요할 것이다. 또한, 카제인과 같은 유즙 단백질이 크로마토그래피 용출액에서 나타나는 것으로 보아, 유즙 단백질은 음이온 교환 크로마토그래피나 친화 크로마토그래피에 의해 제거되지 않음을 확인할 수 있었다. 그러므로 초기 전처리 단계에서 유즙 단백질을 제거하기 위한 방 법의 연구가 유즙 내 목적 단백질을 정제하는데 있어서 중요한 문제가 될 것이다.
