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pp.452-458
호열균 B. stearolhermophilus의 세포내 PPIase를 정제하여 Edman법으로 N-말단 아미노산 배열을 결정하여 이를 바탕으로 합성한 올리고누클레오티드의 프리머를 이용하여, 서턴 분석하여 PPIase 유전자 약 3.0kb를 클로닝하였다 (pPI-40). PPI-40으로부터 PPIase N-말단 배열을 코드하는 영역으로부터 합성한 프리머(A-1, B-2)를 이용하여, PCR법으로 PPIase N-말단을 코드하는 유전자를 증폭하여, 염기배열을 결정한 후, 그 정보에 따라 유전해석한 결과 PCR로 증폭된 단편(pSN-18)은 165염기로부터 형성된 55 아미노산잔기를 코드하는 open reading frame (ORF)이 계속되고 있었고, Edman법으로 결정한 PPIase N-말단 아미노산 39 아미노산잔기가 완전히 일치하였다. 이 결과로부터 pSN-18의 ORF은 PPIase 구조 유전자의 약1/3에 해당하는 단편임을 확인하였다. 그리고, 이 ORF를 중심으로, 지금까지 클론화된 대장균의 PPIase (cytoplasm)와 PPIase b(periplasm)의 아미노산 일차구조 해석으로부터 각각 58%(cytoplasm), 16% (periplasm)의 상동성을 나타냈다. PPIase 구조 유전자를 갖는 재조합플라스미드 pPI-40을 JM109로 형질전환하여 Lac 프로모터로 PPIase 단백질을 발현시켰다. 효소 분자량을 SDS-PAGE로 확인한 결과 약 18kDa으로 호열균 B. stearolhermophilus로부터 정제한 단백질 분자량과 동일하다.면역억제(CsA, FK506)와의 화학적인 반응은 대장균의 PPIase와 동일하게, 면역억제와는 비감수성으로 나타났다.
A PPlase gene of Bacillus stearothermophilus was screened from a genomic library by plaque hybridization using the A-1 primer as a probe. A PPlase positive plaque contained a 3.0kb insert of the chromosomal DNA. A 3.0kb fragment was subcloned into pUC18, resulting pPI1-40. A DNA fragment encodig the N-terminal portion of the PPlase in pPi-40 was amplified by polymerase chain reaction(PCR) method using the A-1 and B-2 primers. The amplified fragment was cloned into the Sma I site of pUC18 and recombinant plasmid was designated as pSN-18. The nucleotide sequence of 167bp fragment was determined. The deduced amino acid sequence of PPlase was completely matched with the determined N-terminal amino acid sequence of PPlase B. stearolhermophilus. The translated protein sequence of PPlase B. stearolhermophilus was compared with sequence from periplasmic PPlase from Escherichina coil : homogies of 16 and 58%, respectively, were found. The clond PPlase gene was over-expressed in E. coil using pUC19 as an expression vector. The enzyme was partially purified by heat treatment and colum chromatochraphy on DEAE-Sepharose CL-6B. The molecular weight of the enzyme was dermined to be about 18.0 kDal by SDS-PAGE.
