We observed MMPs expression in all sperm groups, with pro-MMP showing lower expression than active MMPs. According to the results from each freezing extender, the sperm membrane integrity (HOST: Hypoosmotic Swelling Test) analysis in TCGGD (Tris 250 mM, Citric acid 88 mM, Glucose 47 mM, Glycerol 3%, Dimethylsulpoxide 3.5 M) is 59.8 ± 0.7, TCGSD (Tris 250 mM, Citric acid 88 mM, Glucose 47 mM, Sucrose 0.1 M, Dimethylsulpoxide 3.5 M) is 59.3 ± 0.5 were significantly higher (p < 0.05) among the experimental groups. And MMPs analysis result, we observed MMPs expression in all sperm groups, with pro-MMP showing lower expression than active MMPs. The expression of active MMP-2 was the highest in sperms frozen in TCGSD and TCGD (Tris 250 mM, Citric acid 88 mM, Glucose 47 mM, Dimethylsulpoxide 3.5 M), Meanwhile, sperms from the TCGGD and TCGED (Tris 250 mM, Citric acid 88 mM, Glucose 47 mM, Ethylene glycol 3%, Dimethylsulpoxide 3.5 M) group showed lower level of active MMP-2 expression. Together, these results indicate that adding glycerol or sucrose to the sperm freezing buffer would not only suppress MMPs expression but also minimize DNA fragmentation, providing a mean to improve the success rate in the in vitro manipulation of rabbit sperms. Therefore, these results suggest that TCGGD or TCGSD extender method for freezing-thawing of rabbit sperm increased the viability after thawing.

본 연구는 체세포를 이용하여 생산된 복제 한우 수소의 번식능력을 검토하기 위해 실시하였다. 복제 한우 수소(C-38 및 C-39) 또는 일반 한우 종모우로부터 정액을 채취하여 정자의 수 및 동결 전후의 생존성 등을 살펴보았으며, 정자의 운동성 등은 computer assisted sperm analysis(CASA)를 이용하여 측정하였다. 또한, 이들의 수정 능력을 확인하기 위하여 체외수정과 인공수정을 각각 실시하였다. 정액 성상에서는 복제 수소들과 일반 종모우 간에 정액의 양, 정자의 농도 및 동결융해 후의 생존성 등에서 차이가 나타나지 않았다. CASA를 이용한 분석에서 운동성, 곡선 운동 속도(VCL), 직선 운동 속도(VSL) 및 평균 진행 속도(VAP) 등은 복제 수소의 정액이 일반 종모우의 정액에 비하여 유의적으로 높았다(p<0.05). 체외수정에 따른 수정란의 분화율 및 배반포로의 발달율은 복제 수소와 일반 종모우 간에 차이가 나타나지 않았다. 복제소 정액(C-38)을 이용하여 인공수정을 한 5두의 체세포 복제 대리모에서 암수 각각 한 두씩의 건강한 복제 후대 송아지 2두를 생산하였다. 이상의 결과를 종합하여 보면, 실험에 공시된 복제 수소 개체 간의 차이가 나타나기는 하였지만, 복제 수소는 정액 성상과 정자의 운동성 등에서 일반 종모우와 차이가 없었으며. 또한 인공수정을 통해 송아지를 생산함으로써 정상적인 번식능력이 있음을 확인하였다.

본 연구는 생체 내 세포 및 조직배양기로서의 면역결핍동물을 개발할 목적으로 proximal lck promoter와 DT-A gene를 이용하여 형질전환생쥐을 생산하고 이 형질전환생쥐의 면역세포에서 DT-A gene이 발현되는지를 분석하였다. 형질전환생쥐와 정상생쥐로부터 thymus, spleen 및 liver에서 RNA를 추출하여 RT-PCR수행하였는데 정상생쥐의 조직에서는 어떠한 DT-A gene의 발현양상을 얻을 수 없었으나 형질전환생쥐의 thymus, spleen, liver에 DT gene의 발현을 확인할 수 있었고, Northern blotting을 이용하여 형질전환생쥐의 thymus, spleen 및 liver에서 DT-A gene이 강하게 발현되는 것으로 나타났다. 형질전환생쥐 F₁ 및 F₂ 산자의 혈액에서 T-cell 발달의 분포도를 확인하기 위해 CD4 및 CD8 ntibody를 이용하여 FACS analysis를 실시하였는데 형질전환생쥐의 혈액 내 mature T-cell인 single positive thymocyte의 수가 정상생쥐에 비해 감소하는 경향을 나타냈다. 정상생쥐의 혈액 내 T-cell 중 CD8/sup +/ T-cell의 경우 약 50%를 나타냈으나 형질전환생쥐의 경우 33%로 감소하였고, CD4/sup +/ T-cell은 정상생쥐에서 10%를 차지하고 있으나 형질전환생쥐에서는 5.9%로 감소되는 것으로 분석되었다. 그러므로 본 연구의 형질전환생쥐에서 lck promoter에 의해 초기 immature한 상태의 T-cell에서 DT-A gene이 발현되어 발육중인 T-cell이 파괴 되어 mature 상태인 CD4/sup +/ CD8/sup -/나 CD4/sup -/CD8/sup +/ cells (single-positive)들이 감소된 것으로 확인되었다.

본 연구는 생체 내 세포 및 조직배양기로서의 면역결핍동물을 개발할 목적으로 proximal Ick promoter와 DT-A유전자를 이용하여 형질전환생쥐를 생산하였고 형질전환생쥐의 면역기관에서 Di-phteria toxin이 발현되어 T-cell이 결핍되는지를 분석하였다. 총 암수 2마리의 형질전환생쥐를 PCR과 South-ern blotting으로 분석하여 얻었으며 이식유전자의 copy수는 약 2∼3 copy가 정착된 것으로 확인되었다. 형질전환생쥐의 thymus, spleen, liver 조직을 분리한 후 total RNA를 추출하여 poly(dT) primer 와 DT 특이적 primer를 이용하여 RT-PCR수행 결과 형질전환생쥐의 thymus, spleen, liver에서 DT gene이 발현되고 있는 것을 확인할 수 있었다. 형질전환생쥐의 이들 조직간에 DT 발현량에는 큰차이는 없는 것으로 확인되었다. 형질전환생쥐의 혈액에서 적혈구, 백혈구 ,혈소판, 헤모글로빈 등이 정상생쥐보다 감소되었고 특히 백혈구수와 혈소판의 수가 크게 감소되어 있는 것으로 나타났다. 또한 형질전환생쥐의 혈액을 CD3 antibody를 이용하여 FACS 분석을 실시하여 형질전환생쥐의 혈액 중 T-cell이 수가 비정상적으로 줄어든 것을 확인할 수 있었다. 본 연구에서는 Ick-DT 형질전환생쥐에서 DT유전자의 발현에 의한 T-cell 결핍을 유도할 수 있는 것으로 나타나 이를 바탕으로 돼지를 이용한 사람의 이종장기 배양용 형질전환동물을 생산하여 응용될 수 있을 것으로 사료된다.

본 연구에서는 한우 태아의 시기별로 35일령, 50일령, 70일령 및 90일령의 fetal fibroblast cell line을 생산하였고, bovine-specific primer와 Y chromosome-specific primer를 이용하여 PCR에 의해 성을 판별하여 각각 암수 2 line의 한우 fetal fibroblast cell line을 확립하였다. 이들 cell line을 계대배양하여 passage number가 10 이상에서 염색체 분석을 실시하였는데 모두에서 80%이상의 세포가 60개의 정상 염색체수의 나타내어 계대배양이 karyotype에 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다. Serum starvation과 confluent 배양 방법을 이용하여 Go 상태로 유도되었는지 확인하기 위해 PCNA antibody를 이용하여 Western blotting 분석을 실시하였는데 PCNA 발현이 현저히 감소되는 것을 확인할 수 있었고, 다시 정상 medium으로 환원시켰을 때 세포분열이 재개되어 Go상태로 유도되었음을 확인할 수 있었다. 또한 serum stravation 방법이 conflent한 배양방법보다 PCNA 발현양이 적은 것으로 나타나 좀더 효율적인 Go 상태 세포 주기 조절방법으로 판명되었다.

MT-GHR(Growth hormone receptor)와 MT-IGF-IR(IGF-1 receptor)유전자를 구축하고 micromani-pulator를 이용하여 토끼 수정란에 유전자를 주입하여 형질전환토끼를 생산하였다. 본 연구에서의 형질전환토끼의 생산효율은 약 3%를 나타내었고 Growth Hormone receptor(GHR)를 가진 형질전환 토끼와 IGF-1 receptor(IGF-lR)를 가진 형질전환토끼를 10마리 이상씩 생산하였다. 또한 정상 토끼와 교배시켜 F₁ 새끼를 얻어 유전자가 다음세대에도 전달되는 것을 확인하였다. GHR 이나 IGF-1R 형질전환토끼의 성장률은 정상토끼보다는 약15∼25% 정도 빠른 경향을 나타냈고 특히 GHR 형질전환토끼의 성장률이 더 높은 것으로 드러나 GHR 및 IGF-lR유전자가 형질전환토끼에서 성장에 영향을 주었다는 것을 확인할 수 있었다.

This study was carried out to determine the sex of genomic and embryonic DNA using polymerase chain reaction(PCR). Bovine specific(216bp) and Y chromosome speicific DNA primers(l4lbp) were synthesized and tested for sexing. Bovine embryos used in this study were produced by in vitro fertilization. Few blastomeres for PCR were bisected by nicromanipulator and demi -embryos were cultured in TCM 199 medium containing 0.1% of solcoseryl. The results obtained were as follows; 1. Average optical density of genomic DNA extracted from blood of Hanwoo was 1.79 0.14. 2. 2. The ratio of the demi-embryos developed to blastocyst was 62.1 and 81.9% in morula and blastocyst, respectively. 3. When DNA of 2~4, 5~10 and more than 11 blastomeres was amplified with Y chromosome specific DNA primer by PCR, appreance rate of Y specific DNA band was 16.7, 46.2 and 40.0%, respectively. At least 5 to 10 blastomeres were required to determine the sex of embryos. 4. The rate of demi-embryos developed to blastocyst was 73.3% in TCM 199 medium supplemented with 0.1% solcoceryl. but 55.6% in control.

This study was carried out to investigate the seasonal effect on the recovery rate of embryos in donors and on the conception rate in recipients following embryo transfer. The results obtained from this experiment were summarized as follows: 1. The ovulation point in winter and summer was 28.6 and 28.6, respectively. There was no difference in ovulation point between two seasons. More embryos recovered in the winter (27,0) than the summer (20.9). 2. The number of CL, unruptured follicle, hemorrhagic follicle, young born and pregnancy rate in the winter were 6.0,4.8,1.5,1.8 and 75%, and those in the summer were 2.9,5.7, 3.8, 2.2 and 46.7%, respectively. The rate of synchronization of recipients in the winter showed better results than that in the summer.