유전자 가위(Engineered nuclease)는 최근 유전자의 특정염기서열을 인식하여 목적 유전자 부위만을 정확히 편집하여 형질 교정을 유도하는 획기적인 기술이다. 본 연구에서는 세포벽으로 인해 형질교정율이 동물 시스템에 비하여 상대적으로 낮은 식물세포에 적용시켜 효율을 높이기 위한 조건을 확립하고자 함을 연구목적으로 하였다. 타겟 유전자인 질소환원효소(Nitrate reductase)에 맞춤 제작된 3세대 유전자가위 RGEN (RNA-guided Engineered nuclease)을 이용하여 페튜니아의 원형질체 수준에서 고효율의 형질교정을 유도시키는 조건을 조사하였다. 종자로부터 기내에서 자란 폐튜니아의 어린 잎을 사용하여 cellulose, viscozyme, pectinEX이 포함된 혼합 효소액을 처리한 후 원형질체의 분리를 유도하였다. 예비 실험으로 PEG와 형질전환에 사용된 플라스미드 DNA인 pBI1221-GFP의 농도를 조절하여 원형질체에 도입한 결과, PEG의 농도가 40%이고 Plasmid DNA의 농도를 50ug을 이용하였을 때, 30% 이상의 가장 높은 유전자 도입 효율을 보이는 것을 확인하였다. 동일한 조건으로 페튜니아 NR 유전자에 맞춤 제작된 CRISPR/Cas9을 원형질체에 도입하여 세포배양을 실시한 후 배양세포로부터 DNA를 추출하여 mid-seq을 통한 변이체 발생 비율을 확인한 결과 최대 12%까지 타겟 유전자의 교정이 유도됨을 확인할 수 있었다. 본 연구에서 확립한 조건을 바탕으로 다른 가지과 작물의 다양한 선별 유전자에 적용시켜 목적 형질의 교정을 유도할 수 있는 새로운 작물 육종기술로 본 유전체 편집기술이 이용되도록 그 기반을 확립할 것이다.

본 논문은 인공적인 단백질인 MCL-1ES BH3M에 관한 것으로 MCL-1ES BH3M를 과발현시 세포사멸을 유도한다. MCL-1L을 주형으로 재조합 PCR을 통해서 MCL-1ES BH3M를 클로닝하였다. 새롭게 클로닝한 단백질인 MCL-1ES BH3M 단백질은 안정성을 유지하기 위해서 PEST 도메인이 제거되어 있으며, 다른 BCL-2 패밀리 단백질과의 결합을 조절하기 위해서 BH3도메인의 Leu-Arg-Arg-Val-Gly-Asp-Gly 서열을 7개의 Ala 잔기로 인위적으로 돌연변이를 유도하였다. MCL-1ES BH3M를 293T 세포에서 과발현할 경우 세포사멸을 유도하였고, 항-세포사멸 단백질인 MCL-1L을 같이 과발현하더라도 세포사멸을 유도하였다. 또한, 과발현시 Caspase 9과 3를 활성화하였으며 면역염색법을 통해서 MCL-1ES BH3M 과발현시 미토콘드리아에 MCL-1ES BH3M 단백질이 부분적으로 위치하는 것을 확인하였다. 이상의 결과로 MCL- 1ES BH3M는 Caspase 9과 3의 활성을 통해서 세포사멸을 유도한다. 결론적으로 본 연구는 세포사멸을 유도하는 새로운 molecule을 클로닝하였고, 이 molecule에 의한 세포사멸 기능을 확인하였다.

BPES(Blepharophimosis/Ptosis/Epicanthus inversus Syndrome)는 FOXL2 유전자의 돌연변이에 의해 유발되는 상염색체 우성질환이다. 눈꺼풀이 갈라지거나 쳐지고 넓은 미간이 나타나는 특징이 있으며, 여성의 조기 난소 부전증(prema-ture ovarian failure, POF)을 일으켜 불임을 유발한다. FOXL2는 forkhead family에 속하는 전사인자로서 FOXL2가 결여된 난소에서는 granulosa cell의 분화가 진행되지 않아 난포 성숙과정의 멈춤과 난자의 폐쇄증을 유발한다. FOXL2를 bait로 하여 rat의 난소 cDNA 라이브러리의 yeast two-hybrid screening을 시행하여 FOXL2 단백질과 상호작용을 하는 small ubiquitin-related modifier(SUMO)-conjugating E2 효소인 UBE2I 단백질을 찾았다. UBC9이라고도 알려진 UBE2I 단백질은 SUMO 변형 과정을 위한 필수적인 단백질이다. Sumoylation은 수 많은 전사인자의 전사능력의 조절을 포함하여 다양한 신호전달체계에 관여하는 번역 후 변형과정이다. 본 연구에서 인간세포인 293T 내에서 면역침전반응 실험을 통해 FOXL2와 UBE2I의 단백질-단백질간의 상호작용을 확인하고, FOXL2의 돌연변이형을 제작하여 yeast two-hybrid system을 이용해 UBE2I와 결합에 필요한 FOXL2의 부분을 규명하였다. 따라서, FOX2에 상호작용하는 UBE2I의 규명은 sumoylation에 의한 FOXL2의 새로운 조절 메커니즘을 시사한다.