폴리드나바이러스(polydnavirus: PDV)는 일부 내부기생봉에 공생하는 이중나선형 DNA 바이러스 분류군이다. Cotesia plutellae bracovirus (CpBV)는 프루텔고치벌(C. plutellae)에 공생하는 일종의 PDV이다. 프루텔고치벌은 어린 배추좀나방(Plutella xylostella) 유충에 기 생한다. 기생 초기에 발현하는 CpBV-ELP1 유전자는 혈구세포에 세포독성을 발휘하면서 기주의 세포성 면역을 억제하여 기생에 중요한 역할을 담당하고 있다. 본 연구는 이 유전자를 담배 식물에서 발현하여 해충에 대한 경구독성을 분석하는 데 목적을 두었다. 재조합 CpBV-ELP1 단백질 이 배큘로바이러스 발현시스템을 통해 합성되어 세포배양액에 분비되었다. 수거된 세포배양액은 일련의 단백질 분리과정(ammonium sulfate 단백질 분획, size exclusion 크로마토그래피, 이온교환 크로마토그래피)을 통해 CpBV-ELP1 단백질을 분리하는 데 이용되었다. 분리된 rCpBV-ELP1 단백질은 파밤나방(Spodoptera exigua) 혈구에 대한 뚜렷한 세포독성을 보였다. CpBV-ELP1은 파밤나방 5령충에 대해서 혈강 주입하여 살충력을 나타냈고, 엽침지법을 이용하여 경구독성을 갖고 있는 것을 확인하였다. CpBV-ELP1 유전자를 CaMV 35S 유전자 프로모터 와 opaline synthase 유전자 전사종결신호를 갖는 pBI121 벡터에 클로닝하여 Agrobacterium tumefaciens LBA4404 세균에 형질전환을 유도하였 다. 형질전환된 세균은 담배(Nicotiana tabacum Xanthi)잎에 감염하여 캘러스를 유도하게 하였고 이후 차세대(T1)를 확보하였다. T1 세대 담배 는 파밤나방에 대한 해충저항성을 갖고 있음을 확인하였다. 이러한 결과는 CpBV-ELP1 유전자가 형질전환작물을 통해 해충방제에 응용될 수 있 다는 것을 제시하고 있다.

이중가닥 RNA (double-stranded RNA, dsRNA)는 표적 유전자의 발현을 억제하는 기능으로 해충방제에 응용되었다. 인테그린은 α와 β 단위체로 구성된 이량체 막 단백질이다. 진핵생명체에서 인테그린은 세포-세포 및 세포-세포외기질의 상호연결에 중요한 역할을 담당한다. 인 테그린 β 단위체 발현을 억제하는 특정한 dsRNA (= dsINT)는 해당 곤충에 뚜렷한 치사효과를 유발한다. 또한, dsINT를 발현시키는 형질전환 된 대장균도 해당 곤충에 뚜렷한 살충력을 가진다. 그러나 이 세균 살충제의 야외 적용을 위해서는 제형화 기술이 필요했다. 본 연구는 dsINT를 발현하는 재조합 세균을 동결 건조시켜 대상 곤충에 대해 살충효능을 검정하였다. 동결 건조된 세균은 파밤나방(Spodoptera exigua) 종령 유충에 높은 섭식독을 일으켰다. 파밤나방에 대해서 Bacillus thuringiensis 상용 살충제 처리는 불과 60%의 살충력을 보이는 반면, 동결 건조된 dsINT 발현 세균과 혼합 처리할 때 살충력은 크게 증가하였다. dsINT 발현 세균은 해당 인테그린 염기서열 유사성에 따라 차이를 보이는 해충 종에 선 택적 독성을 나타냈다. 이 결과는 인테그린에 특이적 dsRNA를 발현하는 세균이 동결 건조 제형화 조건하에서도 살충력을 유지한다는 것을 나타 냈다.

Integrin is a heterodimer protein that locates on cell membrane to interact with neighboring cells or extracellular matrix. A transcriptome analysis of the brassica leaf beetle, Phaedon brassicae, midgut identified both α and β subunits of integrin. RNA interference of β subunit genes significantly impaired survival of both larvae and adults of P. brassicae. A recombinant bacteria expressing double-stranded RNA specific to β integrin of P. brassicae were constructed and showed significant oral toxicities.

배추좀나방(Plutella xylostella)은 시설재배지를 중심으로 국내 자연 상태에서 월동한다. 안동지역에서 이른 봄부터 배추좀나방 성페로몬트 랩을 이용하여 배추좀나방의 성충 발생 시기를 주기적으로 조사한 결과 연중 4 회의 성충 발생 피크를 보였다. 월동 집단을 대상으로 서로 다른 지 역 집단 간 생물적 특성을 조사한 결과 내한성, 약제감수성 및 발육속도에서 뚜렷한 집단 특성을 나타냈다. 분자마커로 집단변이를 분석한 결과 월동세대의 높은 집단변이는 계절이 진행됨에 따라 낮아지는 양상을 나타냈다. 이 결과는 배추좀나방의 국내 월동 집단 사이의 생물적 특성 차이 를 나타냈고, 이들의 높은 유전적 분화는 계절이 진행됨에 따라 감소하여 이들 집단 사이의 개체들의 이동에 따른 유전적 교환이 이뤄졌다는 것을 제시했다.

Oral toxicity of double-stranded RNA (dsRNA) specific to integrin β1 subunit (SeINT) was known in a polyphagous insect pest, Spodoptera exigua. For an application of the dsRNA to control the insect pest, this study prepared a recombinant Escherichia coli expressing dsRNA specific to SeINT. The dsRNA expression was driven by T7 RNA polymerase overexpressed by an inducer in the transformed E. coli. The produced dsRNA amount was proportional to the number of the cultured bacteria. The bacteria gave a significant oral feeding mortality to S. exigua larvae with a significant reduction of the SeINT expression. The resulting insect mortality increased with the fed number of the bacteria. Pretreatment with a sonication to disrupt bacteria cell wall membrane significantly increased the insecticidal activity of the transformed bacteria. Compared to the control bacteria transformed by non-recombinant vector, the larvae fed the bacteria expressing dsRNA specific to SeINT suffered tissue damage in the midgut epithelium, which was characterized by a loose cell-cell contact and a significant cell death. The dsRNA-treated larvae were significantly more susceptible to a Cry toxin derived from Bacillus thuringinesis (Bt) than the larvae treated only with Cry toxin. This study demonstrates that a transformed bacterium expressing dsRNA specific to SeINT has a significant insecticidal activity by oral application against S. exigua and makes the target insects to be highly susceptible to Bt toxin.

Translational control is a strategy for various viruses to manipulate their hosts to suppress any acute antiviral activity. Some cys-motif genes encoded in polydnaviruses or teratocytes act as host translation inhibitory factor (HTIF) to defend the host antiviral activity. A novel cys-motif gene, TSP13, was encoded in the genome of an endoparasitoid wasp, Cotesia plutellae. TSP13 consists of 129 amino acid residues with a predicted molecular weight of 13.987 kDa and pI value at 7.928. Genomic DNA region encoding open reading frame is interrupted with three introns. TSP13 was expressed in Plutella xylostella larvae parasitized by C. plutellae. C. plutellae bracovirus (CpBV) was purified and injected to nonparasitized P. xylostella. In the virus-injected P. xylostella, TSP13 was shown to be expressed by RT-PCR analysis. Thus, TSP13 was turned out to be encoded in the proviral CpBV genome. TSP13 was cloned into a eukaryotic expression vector, which was then used to infect Sf9 cells to transiently express TSP13. The synthesized TSP13 was detected in the culture broth. Purified TSP13 significantly inhibited cellular immune responses. Furthermore, TSP13 entered the target cells and was localized in the cytosol. This study reports a novel cys-motif gene, which is encoded in CpBV genome localized on chromosome(s) of C. plutellae and replicated to be encapsidated in the episomal viral particles during parasitization.

Baculovirus expression system has been used to produce functional proteins of various eukaryotic genes. A polydnaviral gene, CpBV-ELP1, was cloned in an alpha-baculovirus, Autographa californica multiple nuclear polyhedral virus (AcNPV), and expressed in Sf9 cells. CpBV-ELP1 protein was released into the culture medium due to its signal peptide. The culture broth containing CpBV-ELP1 was collected and fractionated with different concentrations of ammonium sulfate. Most CpBV-ELP1 was precipitated in 25-100% ammonium sulfate. The precipitate proteins were separated with a size exclusion chromatography sieving 100 kDa size. CpBV-ELP1 was eluted after relatively high molecular weight protein peaks. The fractions rich in CpBV-ELP1 were collected and further fractionated with an anion exchange chromatography. The purified CpBV-ELP1 was toxic to both larvae of Plutella xylostella and Spodoptera exigua by oral test used as leaf dipping method. A lethal median concentrations (LC50) were 7.5 ㎍/mL (95% CI: 1.2-24.3 ㎍/mL) for 2nd instar larvae of P. xylostella and 4.4 ㎍/mL (95% CI: 1.9-8.4 ㎍/mL) for 3rd instar larvae of S. exigua. These results suggest that CpBV-ELP1 may be applied to develop novel transgenic crops.

배추좀나방(Plutella xylostella)이 국내에서 월동이 가능한 지 명확하지 않았다. 본 연구는 배추좀나방의 내한성에 기초한 야외 노출 실험 을 실시하여 월동 환경 조건을 결정하고, 동계 야외 지역의 배추좀나방 유충 서식지 관찰 및 성페로몬을 이용한 성충 모니터링을 통해 월동이 가 능한 지 조사하였다. 또한 이들 월동집단의 유래를 추적하기 위해 다형유전좌위를 이용한 집단 분석을 실시하였다. 배추좀나방의 체내빙결점 보 다 높은 -5℃로 처리한 결과 모든 미성숙 발육태에서 뚜렷한 생존력 저하를 보여 직접적 냉해 피해를 주었다. 여기서 유충발육태는 가장 낮은 냉 해 피해를 받았다. 그러나 5℃로 장기간(4 주) 처리한 결과 냉해 피해는 없었지만, 유충의 경우 먹이가 없는 상태에서 치사율이 증가했다. 모든 발 육태의 배추좀나방을 대상으로 겨울 기간 동안 야외조건에 노출시킨 결과 모든 발육태에서 생존력 저하를 나타냈다. 그러나 비가온 실내조건에서 저온 피해를 줄였으며 유충의 경우 먹이가 공급되면 생존력이 뚜렷하게 증가하였다. 동계 성페로몬 모니터링 결과 2014년도 최초의 성충발생일 은 유사한 시기에 서로 다른 지역(약 260 Km 거리)에서 나타났으며 월동집단의 성충은 4월 상순까지 포획되었다. 지역간 이들 월동집단의 유전 적 거리는 다형분자마커를 이용하여 분석되었으며 이들 월동집단들 사이에 뚜렷한 유전적 분화가 있는 것을 나타냈다. 본 연구는 배추좀나방의 국내 월동이 남쪽 지역 또는 기주 식물이 있는 시설재배지에서 가능한 것으로 제시하고 있다.

Double-stranded RNA(dsRNA) had been used to specitically suppress target gene expression at post-tanscription level. Injection of dsRNA to hemocoel is the most efficient to knockdown target mRNA. However, some insects have shown to be susceptible to feeding dsRNA. Spodoptera exigua was susceptible to dsRNA at oral treatment. Especially dsRNA specific to β-integrin was potent to survival of S.exigua larvae. This study advanced our dsRNA application technology by generating recombinant E.coli expressing dsRNA specific the β-integrin. A recombinant vector L4440 was constructed with a partial β-integrin gene under T7 RNA polymerase promoter. The recombinant vector was used to transform HT115 competent cells of E.coli. The transformed E.coli expressed the dsRNA. The production of dsRNA was proportional to the bacterial number. By feeding the recombinant E.coli, S.exigua underwent significant mortality. By adding E.coli expressing Cry1Ca Bt toxin to E.coli expressing dsRNA, S.exigua exhibited highly enhanced mortality. This study suggests a possibility to use a recombinant E.coli expressing dsRNA to control S.exigua.

A novel oxidant fumigation (NOF) has been considered as alternative fumigant to replace methyl bromide that is a serious ozone depleter. Its high oxidative activity has been used as a bleaching or sanitary agent. Though some reports an insecticidal activity of NOF, its insecticidal action is yet to be understood. This study was conducted with an observation of an insecticidal activity of NOF against Plodia interpunctella, which is a stored grain insect pest. Cytotoxicity test was performed by using MTT assay, NOF gave a significant cytotoxicity on both Sf9 cells and HiFive insect cell lines. Sf9 cells were higher susceptible (IC50 = 43.2+ 3.5 ppm) to chloride dioxide than HiFive cells (IC50 = 174.6 + 5.9 ppm). To understand its cytotoxic effect on P. interpunctella, the larval hemocytes were incubated in vitro with different doses of NOF for 40 min at room temperature. In a dose-dependent manner, NOF gave a significant toxicity to the hemocytes. When NOF was injected to larvae of P. interpunctella, it significantly reduced total hemocyte counts compared to control. These results indicate that NOF has cytotoxic effect against hemocytes of P. interpunctella. This hemolytic activity of NOF can be regarded as a lethal factor to the stored grain insect pest.