본 연구는 팽이버섯 수확 후 배지를 첨가하여 호밀 사일리지 제조 시 팽이버섯 수확 후 배지를 에너 지원으로서 사용하기 위하여 in vitro 반추위 발효실험이 수행되었다. 공시 사일리지는 출수기의 호밀 에 팽이버섯 수확 후 배지 첨가비율(0%, 20%, 40%, 60%)에 따라 제조하여 6주일간 발효시켰다. In vitro 배양액 제조를 위한 반추위액은 농후사료와 볏짚을 40:60의 비율로 급여한 반추위 cannula가 시 술된 Holstein 수소 2두로 부터 채취하였다. In vitro 실험은 발효시간대를 3, 6, 9, 12, 24 및 48시간 으로 설정하고, 각 처리구별로 3반복으로 발효특성과 건물소화율을 측정하였다. In vitro 배양액의 pH 는 발효시간이 길어짐에 따라 낮아지는 경향이었으며, 48시간 경과 시에는 버섯수확 후 배지 60% 첨가 구가 타 처리구에 비해 유의적(p<0.05)으로 낮았다. 미생물 성장율은 배양시간이 경과함에 따라 증가 하는 경향이었으며, 발효 48시간 경과 시에는 버섯수확 후 배지 20% 첨가구가 타 처리구에 비해 유의 적으로(p<0.05) 높았다. Gas발생량은 48시간 발효 시에 대조구가 타 처리구에 비해 유의적(p<0.05)으 로 높았다. 건물소화율은 버섯수확 후 배지의 첨가비율이 높을수록 높았는데, 발효 24시간 및 48시간에 는 R-60구가 처리구 중에서 가장 높았으며(p<0.05), 대조구에서는 전 발효기간 동안 건물소화율이 현 저히 낮은(p<0.05) 상태에 있었다. In vitro 반추위내 발효실험의 결과와 버섯수확 후 배지의 활용성을 고려할 때, 호밀사일리지 제조 시 팽이버섯 수확 후 배지 첨가비율을 원물기준으로 60%수준이 가장 긍 정적인 것으로 나타났다. 향후 대사시험이나 사양시험을 통하여 가축사료로써의 최적 대체 비율을 규명 해야 할 것으로 사료되는 바다.