본 연구는 혈통이 확인된 한우 암소의 체중과 월령에 따라 난소에서 난포의 분포 양상을 확인하고, 체외성숙배양 배지가 채취된 미성숙 난자/난구세포의 배양시 분할율에 미치는 영향을 확인하고자 수행하였다. 도축장에서 도축된 암소들의 혈통, 생체중, 및 월령을 기준으로 적출된 난소를 분류한 후, 난소 모양, 황체, 백체 및 난포액 분포 양상을 확인하였고, 개체별 한우 난소에서 18G 주사침이 장착된 5ml 주사기를 이용하여 난자를 채취한 후, 실체현미경으로 관찰하여 난구세포가 난자주변을 둘러싸고 있는 난자를 회수 하였다. 회수한 미성숙난자를 25mM HEPES 와 10% FBS 가 첨가된 TCM-199 으로 옮겨 2~3 회 세정한 후, follicle stimulating hormone(FSH, Sigma) 0.5 μg/ml, luteinizing hormone(LH, Sigma) 0.5μg/ml, β-estradiol(Sigma)1μg/ml 가 첨가된 미성숙 난자의 체외성숙배지 BO, TCM199, 및 IVMD101 를 각각 사용하여 22 시간 동안 38.5℃, 5% CO2 배양기에서 성숙시켰다. 동결정액은 동일한 보증씨수소 정액을 37.5℃에서 30 초간 융해 하였으며, 최종 정자에는 IVF100 을 첨가하여 각각의 정자 droplet 에 난자들을 38.5℃, 5% CO2 조건의 배양기에 5~6 시간동안 체외수정 하였다. 연구 결과, 무혈통 번식 한우의 체외성숙 배지별 분할율은 BO 배양액에서 23.99%였고, TCM199 에서 47.99%, IVMD101 에서 40.04%로, BO 가 가장 낮았고 TCM199 가 높은 경향을 나타냈다. 개체별 체중에 따른 난자의 체외성숙 배지별 분할율은 480kg 미만의 경우, TCM199 에서 72.73%였고, IVMD101 에서 33.77%로 TCM199 이 월등히 높았다. 480-639kg 의 경우, TCM199 에서 50.05%였고, IVMD101 에서 55.11%로 IVMD101 가 높았으나 비슷한 양상을 나타냈다. 640-699kg 의 경우는 TCM199 에서 65.38 %였고, IVMD101 에서 47.92%로 TCM199 가 높았으며, 700kg 이상의 경우에는 TCM199 에서 61.75%, IVMD101 에서 55.63%로 TCM199 가 더 높게 나타났다. 개체별 월령에 따른 난자의 체외성숙 배지별 분할율은 39 개월 미만의 경우, TCM199 에서 62.41%, IVMD101에서 50.00%로 TCM199 이 높았고, 39-50 개월미만의 경우에는 TCM199 에서 51.22%, IVMD101 에서 49.89%로 TCM199 이 더 높은 경향을 보였다. 50 개월 이상의 경우에는 IVMD101 에서 57.40%로 TCM199 에서 52.25%보다 높게 나타났다. 결과적으로 체중별로 채취된 난자는 TCM199 에서 분할율이 높았으며, 월령별로 채취된 난자는 50 개월이상의 경우 IVMD101 에서 분할율이 높았으나 39-50 개월미만과 39 개월미만의 경우 TCM199 에서 분할율이 높아 다른 경향을 보였다. 본 연구결과를 바탕으로 체중, 월령 및 배양 배지에 따라서 분할율의 향상과 이때 발현되는 번식형질 유전자의 발현에 관한 연구가 필요할 것으로 사료된다.

본 연구는 체외성숙된 돼지난포란을 액상정액으로 수정시 수정시간과 배양배지가 난포란의 발달에 미치는 영향을 조사하기 위하여 실시하였다. 정자농후정액 (30∼60 ml)을 채취하여 실온에서 2시간 정도 서서히 냉각시킨 후, 정액을 15 ml 튜브에 담아 800×g로 10분간 원심분리하였다. 상층액은 버리고 하부의 정자는 5 ml LEN 희석액으로 1×10/sup 9/ 전자/ml가 되도록 재희석하였다. 희석된 정액은 4℃ 냉장고에 보존하였다. 미성숙 난모세포의 성숙에 사용된 배지는 26.19 mM sodium bicarbonate, 0.9 mM sodium pyruvate, 10 ㎍/ml insulin, 2 ㎍/ml vitamin B/sub 12/, 25 mM HEPES, 10 ㎍/ml bovine apotransferrin, 150 μM cysteamine, 10 IU/ml PMSG, 10 IU/ml PMSG, 10 IU/ml EGF, 0.4% BSA, 75 ㎍/ml sodium penicillin G, 50 ㎍/ml streptomycin sulfate그리고 10% pFF를 첨가한 TCM-199 배지였다. 22시간 성숙 배양한 후 난모세포는 cysteamine과 hormone들을 배제한 후 38.5℃, 5% CO₂ incubator에서 22시간 더 성숙시켰다. 성숙된 난모세포는 채취 후 2일간 4℃에 보존된 액상정액으로 수정되었다. 난모세포는 500 μl mTBM 수정 배지에서 1×10/sup 6/ 정자/ml의 농도로 1, 3, 6 그리고 9시간 동안 수정시켰다. 그 후 난모세포는 500 μl NCSU-23, Hopes buffered NCSU-23, PZM-3 그리고 PZM-4 배양배지에 옮겨서 6, 48 그리고 144시간을 더 배양하였다. 정자침투율, 웅성전핵형성율 그리고 난모세포의 난할율은 6 및 9시간 수정시간에서 1 및 3시간 수정시간 보다 높았다. 6시간 수정시 배반포형성율 (33.6%)은 1, 3 그리고 9시간 수정시 배반포형성율 (11.4, 23.0 그리고 29.6%) 보다 높았다. 배반포의 평균세포수는 6, 9, 3 그리고 1시간 수정시 각각 32.9, 27.6, 26.3 그리고 24.4개 였다. 분할된 난모세포의 배반포형성율 그리고 배반포의 평균세포수는 NCSU-23, PZM-3 그리고 PZM-4 배양배지보다 HEPES buffered NCSU-23 배양배지가 우수하였다. 결론적으로 4℃ 보존 돼지액상정액은 체외성숙된 돼지 난모세포의 체외수정에 사용될 수 있음이 입증되었다. 또한 체외성숙된 돼지 난모세포는 500 μl mTBM 수정배지에서 1×10/sup 6/ 정자/ml로 6시간 공배양시키는 것이 바람직하며, HEPES buffered NCSU-23 배양배지에서 배양하는 것이 좋다는 결과를 얻었다.

This study was carried out to evaluate the effect of culture methods on development of embryos with each developmental stage after heat shock in bovine oocytes. The results obtained were as fellows. 1. The culture method after heat shock on development of embryos was better drop-culture than co-culture. 2. The medium without amino acids were not effect of heat sock on development of embryos but it was in need of amino acid during formation of blastocyst.