Spermatozoa viability can be assessed by microscopy, flow cytometry, and other methods using fluorescent stain. Flow cytometry can be used to examine the morphological and functional characteristics of spermatozoa in a short time. The purpose of this study was to compare the viability of cryopreserved spermatozoa in Jeju black cattle by two dual fluorescent stain methods. Semen of Jeju black cattle raised in Subtropical Livestock Research Institute, National Institute of Animal Science, RDA were collected with artificial vaginal technique. Sperm was diluted with Triladyl®-egg yolk diluent and then was performed cryopreservation.There was no significant difference in viability of spermatozoa according to the two dual fluorescent stain methods. However, when the distribution of spermatozoa according to the staining method was compared, the spermatozoa group stained with 6-CFDA/PI was more clearly distinguished than the spermatozoa group stained with calcein AM/PI.

정자 생존성은 형광염색법을 실시하여 현미경검사, 세포현광분석, flow cytometry 등 여러 방법 으로 평가될 수 있다. Flow cytometry는 정자의 형태적, 기능적 특징의 여러 가지 항목을 짧은 시 간내에 수천에서 수만개의 정자를 검사할 수 있는 방법으로 기존의 eosin-nigrosin 염색법, HOST의 실험실적 검사나 형광현미경 검사에 비하여 시간 경과에 따른 정액 성상의 변화를 최소화 할 수 있으며 보다 객관적인 결과를 얻을 수 있다. 이 연구는 Flowcytometry를 사용하여 제주흑우의 동결 정액에서 정자의 생존성을 평가하는 2가지 형광염색법의 비교분석을 통해 정자 생존율과 이중 형 광 염색법 유효성을 알아보고자 하였다. 국립축산과학원 난지축산연구소에서 사육중인 제주흑우 2두를 인공질법을 이용하여 채정하였으 며, Triladyl-eggyolk 희석제 희석하여 동결하였다. LN2에 동결보존된 정액 스트로(n=12)를 융해하여 PBS를 이용하여 희석 후 2개로 분획하였으며, 각각 Calcein Am/PI(CAM/PI)와 6-CFDA/PI(CFDA/PI) 의 이중 형광염색을 실시하고 Flow ctyometry로 생존율을 비교 분석하였다. 분석결과 살아있는 정 자의 비율은 29.26±1.28(CAM+/PI-), 27.50±0.76(CFDA+/PI-), 약간의 생체막의 손상이 있으나 살아있 는 정자의 비율은 21.67±4.92(CAM+/PI+), 23.29±2.76(CFDA+/PI+), 생체막의 손상으로 죽은 정자의 비율은 48.44±4.18(CAM-/PI+), 48.61±2.71(CFDA-/PI+)이었으며 각각 형광염색법간의 유의적인 차이 는 없었다(SPSS v18.0, Paired t-test) 본 연구결과 Flow cytometry를 사용하여 정자의 생존율을 평가할 때 CAM과 CFDA의 차이는 존 재하지 않는 점을 알 수 있었으나 형광염색에 따른 세포의 분포를 비교했을 경우 CFDA가 CAM 보다 형광염색에 따른 정자세포 집단의 구분이 명확하였다. 따라서 정자의 생존성 평가시 CFDA 와 CAM은 모두 사용가능하지만, 정자세포의 집단의 구분에 따른 다른 검사를 실시할 경우 CFDA/PI 염색법이 유용하다고 판단된다.

정자 생존성은 정자기능평가에서 중요한 부분이며 Eosin-nigrosin 염색법, Hypo osmotic swelling test법, CFDA, SYBR-14, Hoechst-33342, Calcein AM 등의 형광염색법을 통해 평가될 수 있다. 또한 Flow ctyometer를 이용, 단시간에 형광 염색된 세포를 검사하여 생 존성뿐만 아니라 정자의 여러 기능적 특성을 평가하는 기술이 최근 이용되고 있다. 이 연 구는 Flowcytometry를 사용하여 제주흑우의 동결정액에서 정자의 생존성을 평가하는 2가 지 형광염색법 간의 비교분석을 통해 정자 생존율의 차이가 있는지 알아보고자 하였다. 국립축산과학원 난지축산연구소에서 사육중인 제주흑우 2두를 인공질법을 이용하여 채 정하였으며, 정자 최종농도가 2.0×107/ml가 되도록 Triladyl-eggyolk로 희석 후 4℃에 1시 간 30분간 평형과정을 수행하였다. 그 후 스트로 정액 충전기로 정액을 충전 후 간이 액 체질소 증기 동결법으로 동결하여 LN2에 동결보존하였다. 동결보존된 정액 스트로(n=12) 를 융해하여 PBS를 이용하여 5×105/ml 농도로 희석 후 2개로 분획하였으며, 각각 Calcein Am-PI(CAM/PI)와 6-CFDA-PI(CFDA/PI)의 이중 형광염색을 실시하고 37℃, 15분간 정치 후 Flow ctyometry로 생존율을 비교 분석하였다. 분석결과 살아있는 정자 의 비율은 29.26±1.28(CAM+/PI-), 27.50±0.76(CFDA+/PI-), 약간의 생체막의 손상이 있으나 살아있는 정자의 비율은 21.67±4.92(CAM+/PI+), 23.29±2.76(CFDA+/PI+), 생체막의 손 상으로 죽은 정자의 비율은 48.44±4.18(CAM-/PI+), 48.61±2.71(CFDA-/PI+)이었으며 각 각 형광염색법간의 유의적인 차이는 없었다(SPSS v18.0 통계프로그램 사용). 본 연구결과 Flow cytometry를 사용하여 정자의 생존율을 평가할 때 Calcein AM과 6-CFDA의 차이는 존재하지 않는 점을 알 수 있었으며, 정자의 생존성 평가에 CAM/PI 방법과 CFDA/PI 방법 중 하나를 선택하여 사용 가능하다고 판단된다.