돼지 핵이식 복제수정란의 체외 발달율을 개선하고자, 핵이 주입된 수핵난자를 전기자극 에 의한 융합 후 demecolcine으로 세포질 활성화 처리를 실시하였다. 2-세포기로 분할 전 까지 핵의 이상분열을 억제하여 정상적인 핵형 유지여부 및 demecolcine이 핵의 방출을 유 도하여 탈핵의 전 처리, 핵이식 후 활성화의 후 처리 및 탈핵 전․후 처리를 모두 한 핵이 식 수정란의 체외발달율을 조사하였다. 융합이 이루어진 복제 수정란에 demecolcine을 4시간 처리하였을 때 정상적인 핵 모양인 CLC(clustered chromosomes) 상태는 43.2%로서 무 처리구의 15.0%보다는 높았으며, 1PN (single pronucleus) 상태는 46.9%로서 대조구의 35.0%와는 차이가 없었다. 비정상적인 핵 형인 ≥2PN, PPB+CLC or PN 및 ≥2PN 7.4, 0 및 2.5%로서 무 처리구의 17.5, 22.5 및 10%로서 처리구가 낮았다. 융합 이후 16시간에는 1PN이 85.0%로서 대조구의 56.7%보다 는 높았다. 분할율은 전․후 모두 처리구에서 86.4±2%로서 후 처리(81.3±6%)와 대조구(79.6±6%) 보 다 높았으며, 전 처리의 85.7±2%와는 차이가 없었다. 배반포기로의 발달율에 있어서도 전․후 처리가 18.1±3%로서 전 처리(11.0±3%)와 대조구(11.3±1%)에 비하여 높았으나, 후 처리의 15.5±1%와는 차이가 없었다. 배반포기 수정란의 할구수도 전․후 처리가 21.6±6% 로서 전, 후 처리 및 대조구의 각각 18.8±8%, 19.4±3% 및 19.7±2%보다 많았다. Demecolcine을 돼지 복제 수정란에 처리하면 분할 전까지 핵의 이상 분열을 억제하는 것 이 확인되었으며, demecolcine 처리에 의한 탈핵은 수핵난자의 세포질 손상을 감소시키고 보다 용이하게 할 수 있다. 본 연구에서와 같이 탈핵 및 활성화를 목적으로 탈핵 전․후 처 리를 하였을 때 체외발달율이 다소 개선되는 경향을 보였다.

Oocyte enucleation is essential for somatic cell nuclear transfer (SCNT) in the production of cloned animals or embryonic stem cells from adult somatic cells. Most studies of oocyte enucleation have been performed using micromanipulator-based techniques, which are technically demanding, time-consuming, and expensive. Several recent studies have used chemical-induced oocyte enucleation; however, each has been plagued by low efficiency and toxicity. In this study, I found that the co-treatment of murine oocytes with demecolcine and BMI-1026, a potent cdk1 inhibitor, resulted in a high enucleation rate (97%). This method is entirely independent of a micromanipulator and is suitable for the large-scale production of enucleated oocytes. This new method of enucleation will be useful in SCNT and in the development of handmade cloning techniques.

This study was designed to investigate the effect of kinetin on in vitro development of parthenogenetic porcine oocytes exposed to demecolcine prior to activation. In vitro matured metaphase II stage oocytes were incubated in 0 or 2 g/ml demecolcine supplemented defined culture medium for 3 h and the oocytes were activated electrically. The parthenogenetic porcine embryos were then cultured in 0 or 200 M kinetin supplemented defined culture medium for 7 days. Regardless of demecolcine treatment, kinetin supplementation increased blastocyst rates significantly (7.0% versus 12.1% and 4.9% versus 8.5%; Control versus Kinetin and Demecolcine versus Kinetin + Demecolcine, respectively, p<0.05). Demecolcine treatment before activation tended to decrease blastocyst rates regardless of kinetin supplementation although it is not statistically significant. Total cell numbers in the blastocysts also tended to be elevated in embryos when supplemented with kinetin, however only the result between Kinetin and Demecolcine groups is statistically significant (37.6 7.2 versus 28.1 9.5, respectively, p<0.05). In conclusion, the present report shows that kinetin enhances developmental competence of parthenogenetic porcine embryo regardless of demecolcine pre-treatment before parthenogenetic activation when they were developed in defined culture condition.

본 연구는 소 형질 전환 체세포 핵이식에서 용이한 탈핵을 위해 demecolcine을 이용할 시 탈핵율과 핵이식란의 발육능을 높이기 위한 최적의 조건을 알아보고자 실시되었다. 도축장 유래 미성숙 난자를 18시간 체외성숙 후 제1극체가 확인된 성숙 난자를 0.1, 0.2, 0.4 및 0.8 ug/ml의 demecolcine이 첨가된 배지에서 1시간 더 처리한 다음 세포막이 돌출되어 있는 난자를 체세포 핵이식에 공여하여 각 군간 배반포로의 발육능을 비교하였

본 연구는 demecolcine 처리에 의한 탈핵과 수핵란 세포질의 세포 주기가 소 체세포 핵이식란의 발육에 미치는 영향을 검토하였다. 체외에서 16~20시간 성숙배양된 난자를 극체 방출 유무 및 MI, MII기 난자로 구분하여 0.4㎕/mL demecolcine으로 40분간 처리 후 염색체 부위가 돌출된 난자는 탈핵 후 핵이식에 공시하였다. 소의 귀 피부 세포를 탈핵란에 이식하여 전기융합과 활성화 처리(Ca-ionophore+DMAP)를 거쳐 체외 배양하였다. Demecolcine처리 후 86.2%의 난자가 염색체 부위의 돌출을 보여 이 중 98.8%가 탈핵에 성공하였다. Demecolcine은 핵이식란의 발육에 영향을 주지 않았다. 제1극체 방출란 유래 핵이식란의 배반포 발육율은 극체 미방출란 유래 핵이식란에 비하여 유의적으로 높았다(18.2% vs.4.6%, P<0.05). 한편, MI 난자 유래 핵이식란의 분할율 및 배반포 발육율은(69.4%와 5.9%) MII 난자 유래 핵이식란에 비하여 유의적으로 낮았다(96.7%와 23.9%, P<0.05). 본 연구의 결과는 demecolcine 처리가 소 난자의 탈핵에 매우 효과적이며 MII기 난자가 MI기 난자에 비하여 수핵란 세포질로 더 적절하나 극체 미방출란 및 MI기 난자도 비록 제한적이기는 하지만 핵이식란의 배반포 발육을 지원할 수 있음을 보여준다.