We investigated the change mRNA expression of GtHs subunits (FSHβ, LHβ) in the pituitary, androgen receptor (AR), estrogen receptor (ERα) in gonad and histological observation of gonads in longthooth grouper Epinephelus bruneus by treatment Femara, an aromatase inhibitor (AI). Longtooth grouper (body weight 408±43.1 g; one year) cultured in Future Aquaculture Research Center, NFRDI were used in the experiments. The experiment was conducted for 12 weeks from 21 August 2013. Fish received intramuscular injection of AI at 5 mg/g BW dose in three times every 3 weeks. Fish were sampled pituitary and gonads at 3, 6, 12 weeks post-injection (n=50). The mRNA levels of FSH-β, LH-β in pituitary and AR, ERα mRNA in gonad were evaluated using qRT-PCR and qPCR. The histological change of gonads observed on light microscope. The gonads of control group contained most perinucleolus oocyte. At 3 to 6 weeks post-injection, the gonads of AI-treated group contained a few degenerated oocytes, spermatogonia and spermatocytes. At 12 weeks post-injection, gonads contained spermatids undergoing spermatogenesis. From 6 to 12 weeks post-injection, the expression level of GtHs subunits mRNA in pituitary was significantly higher than control group. The expression level of AR mRNA in gonad was higher than control group from 3 to 12 weeks post-injection. The expression level of ERα mRNA in gonad was lower than control group from 6 to 12 weeks post-injection. These results suggest that immature longtooth grouper with AI treatment induced masculinization via change of GtH subunits in pituitary, AR and ERα mRNA in gonad.

Kiss/GPR 54 system은 포유류에서 성 성숙 및 번식과 연관되어 있는 것으로 밝혀지고 있으며, 어류의 성 성숙 및 번식 과정에서도 Kiss/GPR 54 system이 중요한 역할을 할 가능성이 높다. 어류에서는 포유류와 달리 Kiss1 뿐만 아니라 Kiss2 유전자도 존재한다는 것이 밝혀졌다. 어류에서 Kiss2는 대부분 아미노산 서열 FNFNPFGLRF를 갖는 decapeptide를 생성하는 유전자이다. Kiss2 유전자는 시상하부에서 GnRH neuron을 자극하여 GTH 분비를 촉진시킨다고 알려져 있다. 그러나 뇌하수체에서 kisspeptin의 직접적인 영향은 아직 불명확하거나 결과가 상이하다. 본 연구에서는 나일 틸라피아(O. niloticus)를 대상으로 나일 틸라피아 Kiss2 유전자의 kisspeptin-10(Kp-10, FNYNPLSLRF) 투여가 뇌하수체에서 직접적으로 번식관련 유전자를 조절할 수 있는지 in vitro 실험을 통해 조사하였다. 사용된 실험어는 나일 틸라피아로 체장과 체중은 각각 13.06±0.76 cm, 39.88±9.48 g이였다(n=16). 멸균조건에서 뇌하수체를 적출하여 96-multiwell plate에 80%(v/v) Leibovitz L15 medium(Gibco), pH 7.4, 10% fetal bovine serum, 100 IU/ml penicillin, 그리고 100 μg/ml streptomycin이 첨가된 배양액에 각각 수용하였다. 뇌하수체를 안정화시키기 위해서 암조건에서 27℃로 3시간 배양한 후 나일 틸라피아 Kiss2 유전자의 Kp-10을 첨가한 배양액(0, 0.01, 1, 100 μM)으로 교환해 주었다(n=4 per treatment). 새로운 배양액에서 16시간 배양 후 각각의 뇌하수체로부터 TRI Reagent (MRC, Inc.)를 이용해 total RNA를 추출하였다. 추출한 total RNA(1 μg)을 이용해 cDNA를 합성 한 후 Kp-10 투여 농도 별로 GTH subunits(LHβ와 FSHβ)의 발현량을 qRT-PCR로 비교하였고, 참조유전자는 β-actin을 이용하였다. 뇌하수체에서 LHβ, FSHβ mRNA 발현은 Kp-10 투여농도에 의존하여 영향을 받았다. LHβ, FSHβ 모두 Kp-10 1 μM 투여구에서 가장 높은 발현량을 나타냈으며, Kp-10 100 μM 투여구에서 다시 낮아지는 경향을 나타냈다. 이러한 결과는 100 μM의 농도가 mRNA 발현을 촉진시키는데 적정한 농도 수준을 벗어난 과도한 농도였기 때문으로 판단된다. 본 연구는 뇌하수체에서 Kisspeptin이 직접적으로 GTH subunits을 조절할 수 있다는 가능성을 확인하였다. 그러나 Kisspeptin을 이용한 최적의 투여효과를 조사하기 위해서는 Kp-10 농도범위와 배양시간을 좀 더 세분화하여 실험을 진행할 필요가 있다.