The role of transient receptor potential vanilloid receptor-1 (TRPV1) has been primarily investigated in pain sensory neurons. Relatively, little research has been performed in testicular cells. TRPV1 is abundantly expressed in Leydig cells of young adult mice. This study was conducted to determine the role of the TRPV1 channel in Leydig cells. TRPV1 modulators and testosterone were treated to the mouse Leydig cell line TM3 cells for 24 h. Capsaicin, a TRPV1 activator, dose-dependently induced cell death, whereas capsazepine, a TRPV1 inhibitor, inhibited capsaicin-induced cell death. Testosterone treatment reduced capsaicin-induced cell death. High concentrations of testosterone decreased TRPV1 mRNA and protein expression levels. However, TRPV1 modulators did not affect testosterone production. These results showed that capsaicin induced cell death of Leydig cells and that testosterone reduced capsaicininduced cell death. Our findings suggest that testosterone may regulate the survival of Leydig cells in young adult mice by decreasing the expression level of TRPV1.

The ultrastructures of germ cells and the functions of Leydig cells and Sertoli cells during spermatogenesis in male Kareius bicoloratus (Pleuronectidae) were investigated by electron microscope observation. Each of the well-developed Leydig cells during active maturation division and before spermiation contained an ovoid vesicular nucleus, a number of smooth endoplasmic reticula, well-developed tubular or vesicular mitochondrial cristae, and several lipid droplets in the cytoplasm. It is assumed that Leydig cells are typical steroidogenic cells showing cytological characteristics associated with male steroidogenesis. No cyclic structural changes in the Leydig cells were observed through the year. However, although no clear evidence of steroidogenesis or of any transfer of nutrients from the Sertoli cells to spermatogenic cells was observed, cyclic structural changes in the Sertoli cells were observed over the year. During the period of undischarged germ cell degeneration after spermiation, the Sertoli cells evidenced a lysosomal system associated with phagocytic function in the seminiferous lobules. In this study, the Sertoli cells function in phagocytosis and the resorption of products originating from degenerating spermatids and spermatozoa after spermiation. The spermatozoon lacks an acrosome, as have been shown in all teleost fish spermatozoa. The flagellum or sperm tail of this species evidences the typical 9+2 array of microtubules.

Estrogen plays an important role both in male and female reproduction. Two estrogen receptor isoforms, Esr1 and Esr2, are expressed in male gonad. In the mouse, Esr1 is expressed in Leydig cells of testis and pituitary. Esr1-/- male mice show enhanced androgen synthesis, spermatogenic defect, and infertility. To evaluate the specific function of Esr1 in Leydig cells, we examined spermatogenesis and steroidogenesis in Esr1f/fCyp17iCre male mice in which Esr1 is deleted specifically in Leydig cells. These mice showed normal spermatogenesis and fertility when compared to wild type from young adulthood to old age. Testosterone synthesis in Esr1f/fCyp17iCre mice at 3-12 months old of age was not different from age-matched wild type mice, while, at 18 months old of age, circulating testosterone concentrations were significantly higher than wild type together with increased levels of Star, Cyp17a1, and Hsd17b3 mRNA and with a hypertropy of Leydig cells. In Esr1f/fCyp17iCre mouse pituitaries, Fshb and Lhb mRNA levels were not different from wild type from young adulthood to old age. Taken together, Esr1 in Leydig cells may be not essential for spermatogenesis and fertility under control of endogenous estrogens and may have a role in aged Leydig cell function.

Aquaporins (AQPs)는 수분통로단백질로서 세포막에서 수분 또는 글리세롤의 수동수송에 관여한다. 현재까지 13종의 AQPs (AQP0-12)가 알려져 있으며, 이 중 AQP9은 수분통로뿐만 아니라 선택적 중성용질통로로도 작동한다. 정소에서 AQP9은 Leydig cell에서 발현하는 것으로 알려져 있다. 본 연구에서는 정소에서 AQP9의 역할을 알아보기 위해 생쥐 정소에서 생후 발달에 따른 AQP9의 발현과 human chorionic gonadotropin (hCG)에 의한 조절에 대하여 조사하였다. 생쥐 정소에서 AQP9 mRNA와 단백질은 2주령부터 발현하였고, 4주령부터 발현량이 급격히 증가하였다. Laser captured microdissection (LCM)을 이용하여 interstitial cell에서 AQP9 mRNA 발현을 분석한 결과, 1주령까지 낮은 발현을 보였고, 이후 발현량이 점진적으로 증가하였다. Immunohistochemistry로 AQP9을 염색한 후 quantitative image analysis를 시행한 결과, 2주령까지 Leydig cell에서 약한 immunoreactivity를 보이다가 4주령부터 세포 크기의 증가와 함께 강한 immunoreactivity를 보였다. Double immunofluorescence로 AQP9과 3β-HSD를 염색한 결과, 미성숙 정소에 비해 성체 정소의 Leydig cell에서 immunoreactivity가 유의적으로 증가하였다. 3주령 수컷 생쥐에 hCG를 주사한 후 정소에서 AQP9 mRNA 발현을 분석한 결과, 발현량이 증가하였으며, adult Leydig cells primary culture를 진행하면서 hCG를 처리한 결과, steroidogenic enzyme 유전자들의 mRNA 발현이 증가하면서 AQP9 mRNA 발현도 증가하였다. 따라서 Leydig cell에서 AQP9은 luteinizing hormone (LH)에 의해 조절되어 수분 및 중성용질을 수송함으로써 steroidogenesis 과정에서 세포 부피의 조절에 관여하는 것으로 사료된다. 흰쥐를 이용한 선행연구들과는 달리 본 연구에서는 세정관내에서도 AQP9이 발현하는 것을 확인하였다. 정소 내 세정관을 분리하여 AQP9 mRNA 발현을 분석한 결과, 2주령부터 mRNA가 발현하는 것이 확인되었고, 이후 발현량이 점진적으로 증가하였다. 또한 LCM을 이용하여 성체 정소의 세정관에서 AQP9 mRNA가 발현하는 것을 확인하였다. Double immunofluorescence로 AQP9과 claudin-11을 염색한 결과, Sertoli cell들간의 밀착결합 (tight junction)에서 함께 발현하는 것을 확인하였다. 따라서 Sertoli cells 사이의 AQP9은 수분 및 중성용질의 통로로 작동하여 이들이 혈액정소장벽 (blood testis barier)을 통과할 수 있게 하는 것으로 사료된다.

Prostaglandin D2 (PGD2)는 배아의 성결정 단계에서 Sertoli cell 분화의 주요인자인 SOX9의 발현을 촉진한다. PGD2는 Prostaglandin D synthase (PGDS)에 의해 Prostaglandin H2 (PGH2)가 이성화되어 만들어진다. PGDS는 스테로이드 생성 관련 유전자인 3β-HSDⅥ, 17β-HSDⅢ와 함께 Leydig cell에서 사춘기 이후 발현되는 것으로 알려져 있으며, lipocalin-type PGDS (L-PGDS)와 hematopoietic PGDS (hPGDS)가 있는 것으로 알려져 있다. L-PGDS는 수컷특이적인 효소로 알려져 있으나, hPGDS는 수컷의 생식소에서는 그 기능이 알려져 있지 않다. 또한, L-PGDS는 여러 조직에서 estrogen에 의해 조절된다고 알려져 있으나, 정소에서는 정확한 조절양상이 알려져 있지 않다. 본 연구는 정소내에서 정자형성 및 스테로이드 생성과정에서 두 가지 형태의 PGDS에서 생성된 각각의 PGD2의 역할을 규명하기 위한 일환으로 생쥐 정소 발생과 성숙단계에 따른 PGDS와 PGD receptor 및 GPR44의 발현을 조사하였으며, estrogen에 의한 PGD2 system의 조절양상을 규명하기 위해 ERα KO와 WT 생쥐에서의 L-PGDS, hPGDS, PGD receptor, GPR44의 발현을 조사하였다. 생후 1, 7, 14, 28, 56일령 생쥐 정소 및 ERα KO와 WT 생쥐 정소로부터 total RNA를 추출하여 정량적 RT-PCR법으로 L-PGDS, hPGDS, PGDR, GPR44의 mRNA 발현을 분석하였고, 정소 파라핀 절편에서 면역조직화학방법으로 L-PGDS, hPGDS, PGDR, GPR44의 단백질 발현을 분석하였다. ERα KO와 WT생쥐 정소 파라핀 절편에서 면역조직화학법을 통해 L-PGDS의 단백질 발현 정도를 분석하였다. 생쥐 정소에서 hPGDS, L-PGDS, GPR44, PGDR의 mRNA 모두 사춘기(생후 28일)이후 발현이 유의적으로 증가하였다. GPR44와 PGDR의 mRNA는 사춘기 이전에는 거의 발현되지 않았다. 하지만 L-PGDS의 경우는 생후 7일, 14일에 비해 생후 1일에서 높은 mRNA 발현량을 보였다. ERα KO와 WT 생쥐 정소 mRNA의 경우 hPGDS와 PGR에서는 차이를 보이지 않았으나 L-PGDS와 GPR44에서는 WT 생쥐보다 ERα KO 생쥐에서 낮은 발현량을 보였다. 면역조직화학법 결과, L-PGDS와 hPGDS는 생후 1일의 fetal Leydig cell에서 주로 발현하였으며, 사춘기 이후 adult Leydig cell에서 발현하였다. GPR44는 Sertoli cell에서 발현되며, 신생기에는 Spermatogonia에, 사춘기에는 elongating spermatid와 round spermatid에, 성체기에는 Leydig cell에서도 발현된다. PGDR은 생후 1일에서 Sertoli cell에서 발현되고, 사춘기와 성체기의 Sertoli cell과 Leydig cell에서 발현된다. 그리고 ERα KO 생쥐에서 L-PGDS는 WT 생쥐보다 낮은 단백질 발현량을 보였다. L-PGDS와 hPGDS는 fetal 및 adult Leydig cell에서 발현되므로 PGD2는 Leydig cell에서 발현되는 PGDR을 통해 Leydig cell의 분화 및 스테로이드 형성과정에 관여하는 것으로 사료된다. 또한 PGD2는 Sertoli cell과 germ cell에서 발현되는 GPR44를 통해 정자형성과정에 관여하는 것으로 사료된다. 그리고 estrogen에 의해 L-PGDS와 GPR44의 mRNA가 발현량이 증가하는 방향으로 조절되고, 그로 인한 단백질 발현 또한 증가하는 방향으로 조절되는 것으로 사료된다.

Estrogen은 estrogen receptor alpha와 beta (ERα, ERβ)를 통해 세포의 생존, 증식 및 분화를 조절한다. 남성의 체내에 미량의 에스트로젠이 존재하며, Leydig cell은 ERα와 ERβ를 발현하므로 에스트로젠은 Leydig cell의 증식 또는 스테로이드형성에 조절기능을 수행할 수 있을 것으로 추측된다. ERα가 전신적으로 적중 (ERαKO)된 수컷 생쥐는 정자형성, 스테로이드생성 및 생식력에 심대한 결함이 있다. 하지만 ERα는 뇌하수체에서도 발현되므로 전신성 ERαKO 모델로 Leydig cell 특이적 ERα의 기능을 이해하기에는 한계가 있다. 본 연구에서는 Leydig cell 특이적 ERα 적중 (ERαflox/flox Cyp17iCre) 생쥐의 정소에서 정자형성, Leydig cell의 증식과 분화특성을 규명하고자 하였다. 생후 2～14개월령의 wild type (WT)과 ERαflox/flox Cyp17iCre 수컷 생쥐를 이용하였다. WT과 ERαflox/flox Cyp17iCre 수컷 생쥐의 혈액을 채취하여 혈중 testosterone, FSH 및 LH 농도를 RIA 분석하였다. WT과 ERαflox/flox Cyp17iCre 수컷 생쥐에서 정소중량을 측정한 후, 파라핀절편을 제작하여 HE 염색을 통해 세정관의 조직학적 특징을 분석하였고, 3β-HSD 면역조직화학법으로 Leydig cell의 수, 단위세포의 면적을 이미지분석 프로그램으로 분석하였다. 또한 WT 암컷과의 교배를 통해 ER αflox/flox Cyp17iCre 수컷 생쥐의 생식력을 분석하였다. WT과 ERαflox/flox Cyp17iCre 생쥐에서 혈중 testosterone, FSH 및 LH의 농도는 유의적인 차이가 없었다. 정소 중량은 2～4개월령에서는 유의적인 차이가 없었지만 10～14개월령에서 ERαflox/flox Cyp17iCre 생쥐의 정소 무게가 WT에 비해 유의적으로 낮았다. 정자형성 장애를 보이는 세정관의 비율은 WT과 ERαflox/flox Cyp17iCre 생쥐에서 유의적인 차이가 없었다. 3β-HSD 염색을 통한 Leydig cell의 분석 결과, Leydig cell 수에는 유의적인 차이가 없었지만, 6개월령부터 ERαflox/flox Cyp17iCre 생쥐에서 WT에 비해 Leydig cell의 면적이 유의적으로 작았다. 수컷 생쥐의 나이에 따라 WT 암컷과 교배한 결과, 9～10개월령의 ERαflox/flox Cyp17iCre 생쥐에서 WT에 비해 생식력이 유의적으로 낮았다. ERαflox/flox Cyp17iCre 생쥐를 이용한 본 연구결과, Leydig cell에서 ERα는 세포의 증식보다는 노화과정에서 세포의 성장에 관여하는 것으로 사료된다. 따라서 Leydig cell에서 ERα의 결함은 세포의 성장을 저해하여 정소의 무게를 감소시키며, 또한 생식력을 저해시키는 것으로 사료된다.