We observed MMPs expression in all sperm groups, with pro-MMP showing lower expression than active MMPs. According to the results from each freezing extender, the sperm membrane integrity (HOST: Hypoosmotic Swelling Test) analysis in TCGGD (Tris 250 mM, Citric acid 88 mM, Glucose 47 mM, Glycerol 3%, Dimethylsulpoxide 3.5 M) is 59.8 ± 0.7, TCGSD (Tris 250 mM, Citric acid 88 mM, Glucose 47 mM, Sucrose 0.1 M, Dimethylsulpoxide 3.5 M) is 59.3 ± 0.5 were significantly higher (p < 0.05) among the experimental groups. And MMPs analysis result, we observed MMPs expression in all sperm groups, with pro-MMP showing lower expression than active MMPs. The expression of active MMP-2 was the highest in sperms frozen in TCGSD and TCGD (Tris 250 mM, Citric acid 88 mM, Glucose 47 mM, Dimethylsulpoxide 3.5 M), Meanwhile, sperms from the TCGGD and TCGED (Tris 250 mM, Citric acid 88 mM, Glucose 47 mM, Ethylene glycol 3%, Dimethylsulpoxide 3.5 M) group showed lower level of active MMP-2 expression. Together, these results indicate that adding glycerol or sucrose to the sperm freezing buffer would not only suppress MMPs expression but also minimize DNA fragmentation, providing a mean to improve the success rate in the in vitro manipulation of rabbit sperms. Therefore, these results suggest that TCGGD or TCGSD extender method for freezing-thawing of rabbit sperm increased the viability after thawing.

MMP-2, 9의 경우 난포의 발달, 난자의 성장, 그리고 배란 시 extracellular matrix를 재 구성하는 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있으며, 혈청배지 및 무혈청배지를 이용한 체외수정란의 배아발달 과정에 따른 MMPs(2, 9)와 TIMPs(2, 3)의 발현양상의 차이가 있 을 것으로 사료된다. 따라서 본 연구는 소의 체외성숙난자와 체외수정방법에 따른 체외수정란의 발달율과 cumulus cell(CC), single oocyte cell(SOC), cumulus oocyte complex(COC) 및 blastocyst 에서 MMPs와 TIMPs의 활성 및 단백질발현양상을 zymography와 ELISA에 의하여 분석 하였으며, immunofluorescence를 이용하여 발현위치분석을 실시하였다. 체외성숙 이후 Real-time PCR을 이용하여 mRNA의 발현양상을 분석한 결과 MMP-2, 9은 CC가 SOC보 다 높은 발현을 보였으며, TIMP-2, 3의 경우 상반된 발현양상을 보이고 있었다. MMPs의 활성도 분석결과도 mRNA의 결과와 같았으며, 배양배지의 MMPs의 단백질양적분석에서 도 같은 양상을 나타내고 있었으나, TIMP-2의 경우 SOC가 높은 발현을 보였으며, TIMP-3는 CC에서 높은 발현을 나타냈다. 위의 결과를 토대로 COC의 MMPs와 TIMPs의 단백질 작용위치를 분석한 결과 MMP-2는 난자의 세포질을 중심으로 발현양상을 나타내 고 있었으며, MMP-9에 비하여 높은 발현을 확인할 수 있었다. TIMPs의 경우 난자의 세 포질보다 난구세포에서의 발현이 높게 나타났으며, TIMP-3의 발현이 높게 나타났다. 체 외배양방법에 따른 blastocyst의 발달율은 무혈청배지(ES)(61.22% 60/98)가 혈청배지(CR- 1aa)(48.28% 28/58)보다 높은 발달율을 보였다. 체외수정배양배지의 MMPs의 단백질양적 분석결과 MMP-2는 ES가 CR-1aa보다 상대적으로 높은 발현을 보였고, MMP-9은 CR- 1aa가 ES보다 높은 발현을 보였다. TIMPs의 발현양상의 경우 대체적으로 TIMP-3의 발 현이 높게 나타났으며, apoptosis의 활성도 분석에서 Casp-3의 발현이 CR-1aa배양에서 높게 나타남을 확인할 수 있었다. MMPs와 TIMPs의 단백질작용위치를 분석한 결과는 ES는 MMPs와 TIMPs의 발현이 inner cell mass를 중심으로 발현이 높게 나타났으며, trophoblast에서는 낮은 발현이 나타났다. 이와 반대로 CR-1aa의 경우 ES와 다른 위치의 발현을 나타냈으며, TIMPs의 발현은 대체적으로 낮게 발현되었다. 따라서 본 연구 결과 는 무혈청배양 방법이 수정란의 발달 시 MMPs의 활성을 높여 배아형성에 영향을 줄 수 있을 것이라 사료된다.

Matrix metalloproteinases (MMP) play important roles in extracellular matrix (ECM) remodeling during ovarian follicular development, oocytes development and ovulation. In an attempt to investigate the effect of MMP activation in development cumulus-oocytes complexes, we examined the localization and expression of MMP, and monitored MMP expression profile. Cumulus-oocytes complexes were collected and matured in vitro for 24 hr, 36 hr and 48 hr. A mRNA expression of MMP-2, MMP-9, TIMP-2 and TIMP-3 was detected in all culture medium regardless of CC, OC and COCs. Activity of MMP-2 in the OC progressively was increased from 24 hr to 48 hr. But MMP-9 was not detected in all culture medium. The localization of MMP-2 was also measured by immunohistochemistry analysis. The MMP-2 and TIMP-2 was detected in cumulus cell and oocyte zone pellucida. Expression of MMP-2 protein in the COCs was progressively increased from 24 hr to 48 hr. However, MMP-9 protein was progressively decreased from 24 hr to 48 hr. And TIMP-2 protein was most highly expressed in the COCs 36 hr. Expression of TIMP-3 protein in the COCs was progressively increased from 24 hr to 48 hr. In conclusion, these results suggest that MMP-2 plays a role in maintaining normal maturation and development by controlling the ECM inhibitor concentration on cumulus cell and oocytes.