곤충의 장내에 공생하는 미생물은 곤충의 소화, 발육, 생존, 번식, 필수성분의 합성 등의 특수한 역할에 영향을 미치는 것으로 밝혀져 있다. 최근에 여러 물질을 분해하는 미생물을 이용하여 환경적, 산업적 등 다양한 분야에서 유용하게 사용되고 있다. 본 연구에서는 여러 꽃무지과의 곤충 중에서 약용 곤충으로 알려진 흰점박이꽃무지의 3령 유충을 대상으로 공급한 먹이와 배설물, 그리고 장내의 미생물을 분리·동정하여 각각의 미생물의 분포를 알아보고자 하였다. 특히나 절지류들은 그들의 장속에서 먹이를 분해할 수 있는 효소를 분비하는 미생물이 서식하는 것으로 잘 알려져 있는데, 본 연구에 이용된 흰점박이꽃무지의 먹이 및 장내 서식하는 미생물들의 cellulose, skim-milk, starch, lignin의 분해 능력을 확인하여 특정 물질에 대해 우수한 분해 능력을 가진 미생물을 선발하고자 하였다. 흰점박이꽃무지의 3령 유충의 소화기관을 채취하여 마쇄한 것과 부엽토, 배설물을 각각 NA배지에 배양한 후 장내세균을 분리 및 동정한 결과, 장에서는 Citrobacter rodentium균주를 포함해 총 7균주, 먹이에서는 Bacillus toyonensis균주를 포함해 총 12균주, 배설물에서 Klebsiella oxytoca균주를 포함해 총 12균주가 확인하였다. 각각에서 분리한 균주들의 물질에 대한 분해 능력을 확인하였는데 cellulose 배지는 Klebsiella oxytoca균주 외 7균주, skim-milk배지는 Bacillus toyonensis균주 외 5균주, starch배지는 Bacillus toyonensis균주 외 4균주, lignin배지는 Citrobacter rodentium균주 외 2균주에서 분해 능력을 확인하였다.

파밤나방에 활성있는 Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki KB100균주에 protease inhibitor인 tannic acid을 혼합처리 했을 때 상승효과를 나타냈다. 본 연구에서는 tannins이 proteases의 활성을 떨어뜨려 나비목 유충의 생장을 억제한다 라는 가설을 토대로 실험을 진행하였다. B. thuringiensis균주와 중장액의 배양시간에 따른 독소의 분해정도를 확인하기 위해 SDS-PAGE를 수행하였다. KB100 toxin을 중장액으로 소화 시켜 시간대별로 단백질 밴드패턴을 확인 한 결과 60kDa의 활성독소가 시간이 지날수록 옅어지는 것을 확인한 반면 tannic acid를 첨가 했을 때는 60kDa의 살충활성 밴드가 계속해서 유지됨을 확인하였다. Trypsin에 의한 B. thuringiensis의 분해능을 SDS-PAGE로 분석한 결과 약 60kDa과 70kDa의 밴드를 나타냈고 tannic acid에 의해서 억제됨을 확인하였다. 파밤나방 중장액에 40mM tannic acid를 처리한 후 각각의 기질에 활성을 측정한 결과 trypsin의 기질인 BApNA, BPVApNA는 각각 62.2±0.3%, 54.5±1.1%의 활성을 나타냈다. 40mM tannic acid의 기질에 대한 단백질 분해 활성 억제정도를 비교한 결과 trypsin 각각의 기질에 대한 활성은 40mM tannic acid를 처리 했을 때 약 30∼40% 활성을 억제하는 것을 확인 하였다. Tannic acid는 serine 계열의 proteases 중에서 trypsin의 활성을 효과적으로 억제하는 것을 예상할 수 있었다. 이와 같은 결과를 토대로 파밤나방 중장 proteases중 trypsin의 서열을 밝히기 위해 5'RACE PCR법을 이용하여 실험을 수행하고 있다.

미국 알래스카주 Anchorage 지진공원과 Denali cantwell 토양에서 분리된 Bacillus thuringiensis(이하 B.t) 균주에서 나방류 해충에 살충활성을 나타내는 새로운 균주 를 선발하였다. B.t는 친환경농업에서 주요 작물보호 농자재로 사용되는 생물농약 으로 곤충병원성세균이다. δ-내독소는 곤충이 섭식할 때에 중장세포막에 결합하 여 이를 파괴하여 영양분의 흡수를 제한하여 치사에 이르게 한다. 선발한 균주의 내 독소 단백질을 위상차현미경으로 관찰한 결과 spore와 crystal 형태를 확인하였다. 난방제 해충인 담배거세미나방(Spodoptera litura), 파밤나방(Spodoptera exigua), 배추좀나방(Plutella xylostella)에 대해 다른 균주와 비교 검토하였다. 단백질 패턴 분석과 담배거세미나방(S. litura), 파밤나방(S. exigua) 중장액을 처리하였을 때 분 해억제정도를 보기위한 SDS-PAGE를 수행하였다. SDS-PAGE의 단백질 패턴 분 석 결과로 plasmid DNA 전기영동을 하여 패턴의 차이를 분석하였다. 또한, 균주에 서 Cry1 내독소 유전자가 존재하는 것을 확인하기 위하여 PCR을 수행하였다.

곤충의 장내세균은 곤충 내에서 곤충의 소화, 발육, 번식, 생존 등 여러가지 역할 을 하는 것으로 밝혀져 있다. 특히, 여러 물질을 분해하는 물질을 분비하거나 항생물 질을 분비하기도 한다. 콩풍뎅이(Popillia mutans)에서 Pseudomonas aeruginosa외 에 4종의 균주가 확인되었으며 이 균주들을 Alternaria solani, Botrytis cinera, Colletotrichum gloeosporioides, Fusarium oxysporum, Phytophthora capsici, Rhizoctonia solani 6종의 병원균과 함께 PDA배지에서 대치배양하여 항균활성을 본 결과, Ps. aeruginosa균주가 A. solani, B. cinera, C. gloeosporioides, F. oxysporum, P. capsici 5종의 병원균 모두에 항균활성을 갖는 것으로 나타났다. 특히, B. cinera 와 P. capsici에 대해 비교적 높은 항균활성을 갖는 것을 볼 수 있었다.

나비목 유충의 소화효소중 Serine protease인 trypsin은 단백질 가수분해과정에 서 주요한 역할을 하는 것으로 알려져 있으나 protease의 지속적인 가수분해결과 독소 단백질의 불화성화를 초래하여 살충활성을 낮춘다고 보고되어 있다. 이 전 연 구에서 Bacillus thuringiensis(이하 B,thuringiensis) subsp. kurstaki KB100균주는 protease inhibitor인 tannic acid와 혼합처리 함으로써 파밤나방의 살충활성에 상승 효과를 나타냈다. 이에 대한 원인을 구명하고자 나비목 유충 중장속 소화액의 다양 한 Protease와 균주특이성에 초점을 두고 실험을 수행하였다. 균주의 특이성을 알아보기 위해서실험실 보관 균주 6종과 기준균주인 B. thuringiensis susp. kurstaki HD-1을 선발하여 총 7종의 균주에 각각 tannic acid를 농도별로 처리하여 생물검정을 실시하였다. B. thuringiensis KB100균주는 40mM tannic acid농도로 혼합처리 했을 때 상승효과를 나타낸 반면 다른 균주는 영향을 끼치지 않았다. 생물검정 결과를 토대로 나비목 유충의 소화효소 중 Serine protease의 활성을 알아보기 위해 protease 특이적 기질을 사용하여 tannic acid가 어떤 종류의 protease activity를 낮추는지 실험을 수행 하였다.

Bacillus thuringiensis(이하 B.t)는 곤충병원성세균으로 친환경농업에서 주요 작물보호 농자재로 사용되는 생물농약 중 하나이다. B.t는 그람양성의 호기성이며, spore와 crystal를 형성하고 포자 형성기에는 균체 내에 δ-내독소라는 독소단백질 을 생성한다. 딱정벌레목인 청동풍뎅이의 사체로부터 분리된 CAB530균주와 영 동 토양에서 분리된 CAB564균주는 나비목 해충에 살충활성을 나타내는 것을 확 인하였다. 위의 균주와 기존에 연구된 KB098, KB099, KB100을 비교하기 위해 실 내에서 누대 사육한 담배거세미나방(Spodoptera litura), 배추좀나방(Plutella xylostella), 파밤나방(Spodoptera exigua), 파리목(Diptera) 해충에 대해 생물검정 을 수행하였다. 단백질 패턴 분석과 담배거세미나방(S. litura), 파밤나방(S. exigua) 중장액을 처리하였을 때 분해억제정도를 보기위한 SDS-PAGE를 수행하 였다. SDS-PAGE의 단백질 패턴 분석 결과로 plasmid DNA 전기영동을 하여 패턴 의 차이를 분석하였다. CAB530균주와 CAB564균주의 내독소 유전자의 Cry형 유 전자를 동정하기 위하여 PCR을 수행할 계획이다.

RNA interference(RNAi)는 살아있는 세포에서 유전자의 표현력을 제어하는 방 법이다. 키틴을 분해하는 Chitinase는 곤충의 탈피에 관여하여 오래된 큐티클의 소 화 재흡수에 도움을 주는 효소이다. Chitinase를 이용하여 RNA interference 효과 를 보기 위해 담배거세미나방으로부터 RNA를 추출하였다. RNA 추출은 담배거 세미나방의 번데기, 번데기 직전의 유충, 5령 유충, 5령 유충의 외피로부터 각각 실 시하였다. RNA 추출물을 주형으로 cDNA를 합성하였고, 시퀀스 분석 결과 담배 거세미나방의 Chitinase의 크기는 약 610bp였다. 추후 담배거세미나방 Chitinase 의 dsRNA 합성과 생물검정을 통해 RNAi 효과를 확인하고자 한다.

곤충병원성세균 Bacillus thuringiensis(이하 B.t)는 친환경농업에서 주요 작물 보호농자재로 사용되는 생물농약 중의 하나이다. B.t는 그람양성세균이며 포자와 crystal을 형성하고 parasporal inclusion을 형성하며 포자형성기에는 균체 내에 δ-내독소라는 독소단백질을 생성한다. δ-내독소는 곤충이 섭식할 때에 중장세포막에 결합하여 이를 파괴하여 영양분의 흡수를 제한하여 치사에 이르게 한다. 본 연구에서는 기존의 B.t제제에 전혀 노출되지 않은 지역으로 추정되는 충북 영동과 옥천 지역의 산과 강 주변에서 채취한 총 43개의 토양샘플로부터 나방류 해충에 대한 살충활성이 우수한 새로운 B.t를 분리 선발하였다. 토양희석액을 nutrient agar plate에 고르게 도말한 후, 27℃에서 3~4일간 배양하고, 형성된 colony들 중에서 배양특성이 B.t와 유사한 74개의 colony를 선발하였다. 위상차현미경으로 포자형성과 crystal의 형태를 확인하는 과정에서 내독소 단백질 결정체를 형성하는 12개의 B.t를 확보하였고 이들 가운데에서 파밤나방에 대한 살충활성을 보이는 균주를 선발하였다.

이전 연구에서 protease inhibitor중의 하나인 tannic acid와 파밤나방에 활성이 높은 7 종의 Bacillus thuringiensis에 각각 혼합 처리하여 파밤나방에 살충활성을 실험한 결과, B. thuringiensis subsp. kurstaki KB100에서만 뚜렷한 상승효과를 보였고 tannic acid가 중장액의 protease중 trypsin의 활성을 가장 잘 억제하는 결과를 보였다. 이를 바탕으로 파밤나방 중장액과 trypsin에 대한 tannic acid와 B. thuringiensis strains와의 특성을 비교하고자 파밤나방 중장액 또는 trypsin과 40mM tannic acid를 섞어 반응시킨 후, 7 종의 B. thuringiensis strains parasporal inclusion에 처리하여 단백질의 분해억제 정도를 알아보기 위해 SDS-PAGE를 수행하였다. 그 결과 모든 7 균주의 parasporal inclusion이 약 133kDa크기의 단백질밴드를 나타내는 것으로 보아 분해가 억제된 것을 확인하였다. 반면에 파밤나방 중장액과의 반응에서는 뚜렷한 분해억제 정도를 보인 균은 KB100균주뿐이었다. 그 이외의 6 균주의 parasporal inclusion에서는 약 60~70kDa크기의 단백질밴드를 나타내 중장액에 의해 분해되는 것을 알 수 있다. 따라서 tannic acid는 파밤나방 중장액의 trypsin의 활성을 억제한다고 할 수 있다. 또한. B. thuringiensis KB100균주의 경우에는 다른 6 종의 균주들과는 달리 parasporal inclusion이 tannic acid에 특이적으로 분해가 더욱 억제되어 약 133kDa의 단백질 밴드를 나타낸 것으로 사료된다.

곤충병원성세균의 Bacillus thuringiensis(이하 B.t)는 친환경농업의 주요 농자재로 사용되는 생물농약 중의 하나이다. B.t는 그람양성세균이며 spore, crystal를 형성하고 parasporal inclusion를 형성을 한다. 포자 형성기에는 균체 내에 δ-내독소라는 독소단백질을 생성한다. δ-내독소는 곤충이 섭식 시 중장세포막에 binding 된 후 중장을 파괴하여 치사에 이르게 한다. 본 연구에서는 경상북도 김천 지역의 밭과 과수원 토양으로부터 총 8곳에서 sample을 채취하여 살충활성이 우수한 B.t를 분리 선발하고자 하였다. 토양희석액을 nutrient agar plate에 고르게 도말한 후 27℃에서 3~4일간 배양한 후 형성된 colony들 중에서 배양특성이 B.t와 유사한 80개의 colony를 선발하였다. 위상차현미경으로 spore형성과 crystal의 형태를 확인하는 과정에서 내독소 단백질 결정체를 형성하는 16개의 B.t를 확보할 수 있었고, 그중bipyramial형 15개와 irregular형 1개가 확인되었다. 분리선발된 16개 균주의 살충활성을 확인하기 위해, 실내 누대 사육한 나비목 담배거세미나방(Spodoptera litura)에 실험한 결과, 높은 사충율을 나타냈다. 추후에 나비목 파밤나방(Spodoptera exgua)에 대한 살충활성을 확인한 후 SDS-PAGE를 통하여 단백질패턴을 분석할 계획이다.

Bacillus thuringiensis(이하 B. thuringiensis) subsp. kurstaki KB100은 protease inhibitor중의 하나인 tannic acid를 혼합처리 함으로서 파밤나방의 살충활성에 상승효과를 가져왔다. 이를 바탕으로 tannic acid가 B. thuringiensis균주 특이성을 나타내는지 확인하기 위해, 국내 토양으로부터 분리하여 실험실에 보관중인 B. thuringiensis중 파밤나방에 높은 살충활성을 보이는 6개의 균주와 기준균주인 B. thuringiensis subsp. kurstaki HD-1을 선발하여 총 7종의 균주에 각각 tannic acid를 농도별로 처리하여 2령 파밤나방에 대해 생물검정을 실시하였다. 또한 선발된 7개의 균주들의 살충성단백질의 패턴과 파밤나방 중장액에 대한 tannic acid의 단백질분해 저해정도를 알아보기 위해 SDS-PAGE를 수행하였다. B. thuringiensis KB100은 tannic acid의 농도를 높일수록 사충이 증가하다가 80mM농도에서 낮아지는 반면에 B. thuringiensis KB098은 tannic acid의 농도를 높일수록 오히려 사충률의 감소를 보였고, 이외 5개 균주는 tannic acid의 농도와 상관없이 뚜렷한 사충률의 변화를 보이지 않았다. 각 균주의 Parasporal inclusion에 tannic acid를 처리하여 파밤나방 중장액에 반응시켜 parasporal inclusion의 분해정도를 SDS-PAGE로 확인한 결과, 133kDa크기의 단백질밴드를 나타내는 각각의 균주가 생성한 parasporal inclusion은 tannic acid처리 농도에 따라 살충활성을 나타내는 70~60kDa단백질크기로의 분해정도가 각각 다른 것으로 나타났다. 이는 Tannic acid가 B. thuringiensis균주에 따른 특이적인 효과를 나타낼 수 있는 가능성을 보여준다.

Bacillus thuringiensis subsp. aizawai KB098 (이하 KB098 균주)은 파밤나방에 높은 살충 활성을 보인다. 해충에 살충 활성을 나타내는 내독소 단백질은 cry gene에 의해 발현이 되는데 cry gene은 주로 Bacillus thuringiensis의 plasmid DNA 상에 존재한다. KB098의 plasmid DNA를 추출하여 PCR을 수행한 결과, Cry1Aa, Cry1Ab, Cry1C, Cry1D 총 4개의 cry gene을 가지고 있는 것으로 확인되었다. KBM-1은 KB098균주를 curing한 mutant 균주로, KB098균주를 42℃조건에서 48시간 배양하고, UV를 조사하여 확보하였다. KBM-1의 plasmid DNA를 PCR한 결과 KB098에서처럼 Cry1Aa, Cry1Ab, Cry1C, Cry1D의 cry gene이 증폭됨을 알 수 있었다. KBM-1은 KB098처럼 crystal을 암호화하는 plasmid DNA를 가지며, cry gene을 보유하고 있다. 반면 KB098과는 달리 KBM-1 균주는 내독소 단백질을 생성하지 못하며 파밤나방의 생물 활성 검정에서 독성을 나타내지 않았다. 이러한 원인을 밝히고자 KBM-1 plasmid DNA의 특정 cry gene의 PCR 결과, 증폭된 cry 유전자 내에서 염기서열의 변화에 기인할 것이란 가정하에, KB098과 KBM-1 균주의 특정 plasmid DNA 상에서 증폭된 cry gene의 염기서열을 비교분석 할 것이다. 이를 통해 crystal 형성에 관여하는 유전자의 변이 유무를 확인할 계획이다.

곤충의 장내 공생미생물은 곤충의 소화, 발육, 생존, 번식, 필수성분의 합성 등의 특수한 역할에 영향을 미치는 것으로 밝혀져 있다. 최근에는 여러 가지 물질을 분해하는 미생물을 이용하여 분해산물과 그 이용 방법을 개발해 다양한 분야에서 유용하게 사용되고 있다. 본 연구에서는 포식성 곤충이며 진딧물의 생물학적 방제인자로 가장 많이 사용되고 있는 무당벌레(Harmonia axyridis)의 장내에 서식하고 있는 미생물의 분리 및 동정을 통해 무당벌레 장내미생물의 종류 및 분리된 장내미생물들의 casein, cellulose, chitin, lignin 분해능력을 확인하여 특정 분해능력을 가진 미생물을 선발하고자 하였다. 무당벌레 유충과 성충의 소화기관을 채취하고 마쇄하여 NA배지에서 배양한 후 장내세균의 분리 및 동정한 결과, Arthrobacter속 외 35균주가 확인 되었으며, 분리된 35개 중 10균주를 casein, cellulose, chitin, lignin을 첨가한 각각의 배지에서 배양하였다. 먹이로 공급된 무테두리진딧물 역시 마쇄하여 장내 미생물을 확인하였는데, Staphylococcus sciuri 를 포함한 5균주가 무당벌레에서와 동일하게 확인되었다. 무당벌레의 장내미생물을 casein, chitin, cellulose, lignin 첨가 배지에 배양한 결과 casein을 분해하는 3균주, chitin을 분해하는 2균주가 확인되었으며, cellulose와 lignin을 분해하는 균주는 확인 할 수 없었다.

나비목유충 소화액의 다양한 Protease는 Bacillus thuringiensis(이하 B. thuringiensis)가 생성한 protoxin의 활성을 결정하는데 가장 중요한 소화효소로 알려져 있다. 나비목유충의 소화효소 중 Serine protease인 trypsin은 단백질 가수분해과정에 주요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 그러나 Protease의 지속적인 가수분해결과 독소 단백질의 불활성화를 초래하여 B. thuringiensis의 살충활성에 부정적인 영향을 초래할 수 있다. 이전 실험에서도 Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki KB100과 protease inhibitor중의 하나인 tannic acid를 혼합하여 중장액에 처리하였을 때, 파밤나방에 대한 살충활성이 높아진 원인으로 protease activity의 감소를 예상할 수 있었다. 따라서 본 실험은 다양한 Protease가 있는 중장액에 protease 특이적기질로 tannic acid가 어떤 종류의 protease activity를 낮추는지 확인하고자 하였다. 파밤나방 중장액과 농도별(10, 20, 40, 80mM) Tannic acid와의 protease activity를 측정 한 결과 tannic acid의 농도가 높아 질 수 록 protease activity(%control)는 각각 83.1±2.1, 77.6±1.6, 68.0±0.4, 40.1±2.2로 감소됨을 확인 하였다. 파밤나방 중장액과 serine(azocasein), trypsin(BApNA, BPVApNA), chymotrypsin(BTpNA, SAAPPpNA, AAVApNA), elastase(SAAApNA, SAAPLpNA) 와의 기질 반응을 분석 한 결과 trypsin 기질에서 protease activity가 높음을 확인 하였다. 추후 연구에서 파밤나방 중장액과 Tannic acid를 반응 시킨 후 기질과의 protease activity를 측정 하고 zymogram을 통해 protease 활성 부분을 연구 할 것 이다.