치밀 난구세포로 둘러싸인 소 난자를 . 5% 배양기에시 5% superovulated cow serum(SCS)이 첨가된 m-TCM 199 medium 으로 시간 배양하였으며, 수정능이 획득된 정자와 체외수정하였다. 7일8일경의 수정란을 1.3M methyl cellosolve(MC), 1.1M diethylene glycol(DEG), 1.8M ethylene glycol(EG), 1.6M propylene glycol(PG) 및 1.1M 1,3-butylene glycol(BG) 용액에서 10분간 평형시킨 후 0.25 ml 스트로내에 장전하였다. 스트로를 의 alcohol bath freezer에 넣고 까지 /분 속도로 냉각, 식빙 후 10분간 정체시켰으며, /분 또는 /분으로 까지 냉각 후 스트로를 액체질소에 침지하여 보관하였다. 수정란이 들어있는 스트로를 온수에서 융해하였으며, 수정란을 TCM 199 medium 으로 옮긴 후 5% SCS가 첨가된 TCM 199 medium 에서 48시간 배양하였다. 수정란이 양호한 형태를 유지하며 나중의 발육단계로 진행된 것을 생존한 것으로 간주하였다. 각 종류의 동해방지제에서 동결된 수정란의 일부는 융해 후 동해방지제를 제거하지 않고 직접 비외과적으로 이식하였다. 동결-융해 후 동해방지제의 종류에 따른 탈출배반포 발달율은 EG 50.0%, MC 53.6%, DEG 56.9%, PG 58.0% 그리고 BG 11.5%였다. /분 또는 /분 으로 냉각한 수정란의 생존율은 두 그룹간에 유의적인 차이가 없었으나 (P<0.05), 탈출배반포 발달율은 -0.5분 /분(22.6%, 12/53)보다 /분(64.6%, 31/48) 냉각시에 유의적으로 높았다(P<0.01). 동해방지제의 종류에 따른 수정란의 수태율은 MC 48%(10/21). DEG 30%(3/10), EG 74%(20/27) 및 PG 40%(4/10) 였다. 이러한 결과로 보아 MC, DEG, EG 그리고 PG는 소의 체외수정란의 동결을 위한 동해방지제로서 이용될 수 있음을 보여주었다.

동물 생명체의 냉동보존 연구는 정자 및 알과 같은 단세포에서 발생배와 같은 다세포 냉동보존기법개발로 이행되어 왔다. 동물 배우자의 냉동보존에 대한 연구는 Polge and Roson (1952)의 가축배우자 냉동보존과 Shemen (1953)의 인간 배우자 냉동보존 시도가 그 효시였다. 한편, 발생배 냉동보존에 관하여는 Whittingham (1971)의 생쥐 발생배 냉동보존 연구가 최초로 이루어진 다음, 2～4세포기에서 포배에 이르기까지 발생배에 대한 냉동보존(Otoi et al., 1995; Carvalho et al., 1996; Dinnyes et al., 1996; Naitana et al., 1996; Im et al., 1997)과 쥐(Shaw et al., 1995), 소(Niemann, 1984; Im et al., 1997)의 발생배에 다양한 냉동률을 적용한 냉동보존 결과가 보고된 바 있다. 그러나 해양생물에 있어 어류나 무척추동물 발생배에 대한 냉동보존 연구는 아직 초기단계로 미미한 실정이다. 특히, 패류발생배의 냉동보존의 연구는 종 다양성이나 연구항목에 있어 부족한 부분이 많다. 더욱이, 참굴과 같은 패류의 양식에서는 발생배의 대량 냉동보존에 의해 연중 종묘생산을 꾀하거나 선발 육종한 굴의 종 보존을 하기 위해 발생배의 냉동보존 기술개발이 절대적으로 필요한 실정이다. 최근 Tiersch (2001)의 버지니아굴에 대한 유생 냉동보존을 위시하여 Choi and Chang (2003)의 진주조개, Pinctada fucata martensii 유생의 냉동보존 연구 등이 있으나, 적정 동해방지제를 찾기 위한 동해방지제 침지실험 등이 이루어지지 않아 체계적으로 연구되었다고 보기 어렵다. 따라서 조개류 발생배의 냉동보존기술을 체계적으로 개발하기 위하여는 발생배의 냉동보존 시 초기발생 단계를 포함한 발생단계별 냉동효과, 침지실험에 의한 동해방지제, 평형시간 구명 및 최종적인 냉동보존 효과 파악을 위한 동해방지제에 따른 활성영향, 적정농도 및 냉동실험이 체계적으로 이루어져야 한다. 본 연구에서는 참굴, Crassostrea gigas 발생배의 최적 냉동보존 조건을 파악하기 위하여 발생배의 동해방지제 침지농도별 활성평가 및 냉동보존 효과를 조사하였다. 2년생 양식산 참굴을 채란용 모패로 사용하였으며, 생식소절개법으로 채란․채정하여 얻은 수정란으로 실험하였다. 동해방지제별, 농도별 침지에 따른 참굴 발생배에 미치는 활성영향을 평가하기 위해, 인공해수(NaCl 2.7 g, KCl 0.07 g, NaHCO3 0.05 g, CaCl2 0.12 g, MgCl2 0.46 g, Milli-Q water 100 ㎖)를 희석액으로 하고, 여기에 dimethyl sulfoxide (DMSO), ethylene glycol (EG), propylene glycol (PG)를 최종농도가 0.1, 0.5, 1.0, 2.0 M이 되도록 혼합한 다음, 발생배를 침지하였다. 10분 경과 시 발생배로부터 동해방지제를 깨끗이 제거한 다음, 5분 간격으로 20분 동안 trochophore, D형유생의 생사 여부 및 운동성을 관찰하였다. 이때 광학현미경(×100)의 한시야에서 움직이는 유생을 다음의 유생운동 평가표에 따라 유생활성지수(larval activity index, LAI)를 산정하였으며, 모든 실험은 3반복으로 실시하였다. 동해방지제별, 농도별 침지에 따른 참굴 발생배의 냉동-해동 후 생존율을 평가하기 위해, 전술한 인공해수를 이용하여 만든 0.2 M sucrose 용액을 희석액으로 사용하였으며, dimethyl sulfoxide (DMSO), ethylene glycol (EG), propylene glycol (PG)을 동해방지제로 사용하여 최종농도가 0.1, 0.5, 1.0, 2.0 M이 되도록 한 다음 실험하였다. 참굴의 trochophore 및 D형유생을 선택하여, 준비한 각 용액에 유생을 실온에서 10분 동안 침지한 후 0.5 ㎖ straw (FHK, Japan)에 넣고, 최초 온도가 0℃로 설정되어 있는 프로그램냉동기(삼원냉열엔지니어링, Korea)에서 냉동속도 －1℃/분으로 －12℃까지 냉각하였다. 이후 －12℃에서 식빙(seeding)한 다음, 다시 냉동속도 －1℃/분으로 또 －35℃까지 냉각하였다. －35℃에 30분 유지한 후, 유생은 즉시 －196℃의 액체질소통(MVE, USA)에 옮겨 보관하였다. 냉동보관 24시간 후 25℃의 담수에서 유생을 급속해동하여 여과해수로 희석한 다음, 광학현미경(×100)에 의해 섬모운동에 의한 유영과 심작박동 여부로 생존율을 조사하였으며, 모든 실험은 3반복으로 실시하였다. 참굴의 발생단계 중 유생의 섬모운동을 시작하는 단계인 trochophore, D형유생을 사용하여 동해 방지제별, 농도별 침지에 따른 발생배에 미치는 활성을 관찰한 결과, 각 유생의 LAI는 모든 동해방지제의 0.1 M 농도에서 높았으며, 농도가 높을수록 LAI가 낮아짐을 알 수 있었다. 동해방지제 침지농도에 따른 유생의 반응은 농도가 낮은 실험구에서 비대칭 나선운동이 멈추었으나, 농도가 높아질수록 섬모운동을 멈추고 움직이지 않는 채로 심장박동만 관찰되었다. Trochophore보다 D형유생을 사용한 실험구에서 전체적으로 LAI가 높아 D형유생을 사용한 실험구가 trochophore 실험구보다 동해방지제에 대한 내성이 강한 것으로 나타났다. 각각의 동해방지제 중에서 EG에 침지한 유생의 LAI가 다른 동해방지제보다 유의하게 높아, EG이 참굴 발생배의 냉동실험에 가장 적합하였다. 동해방지제별, 농도별 희석액 0.2 M에서 참굴 trochophore 및 D형유생의 냉동-해동후 생존율은 2.0 M EG에서 가장 높았으며, 유생의 생존율은 각각 63.0±12.3%, 88.8±4.3%였다.

최근 생물다양성 연구가 세계적으로 진행됨에 따라 돗돔, 홍어 등 어획자원 격감어종의 종 보존에 대한 관심이 고조되고 있다. 희귀어종으로 대형종인 돗돔은 전설의 물고기라 불리우며, 그 맛도 일품인 것으로 알려져 있다. 이 돗돔의 자원증강을 위한 종 보존 및 양식기술을 개발하기 위하여, 일부 연구기관에서는 현장에서 어획된 돗돔으로부터 종묘생산을 시도하고 있지만, 어획된 돗돔 어미의 성비가 부조화하거나, 완숙된 알과 정자의 동시 구득이 어려워 인공수정 작업이 불가능한 실정이다. 따라서 자연산 돗돔의 원만한 인공수정을 위하여 배우자의 냉동보존 기술이 필요하다. 본 연구에서는 돗돔의 효과적인 정자 냉동보존 방법을 구명하고자 동해방지제별, 농도별 정자의 활성지수 및 운동시간을 조사하였다. 실험용 돗돔은 전장 165 ㎝, 체중 90 ㎏인 자연산 수컷 돗돔으로서 동경 128˚ 35″, 북위 35˚ 04″ 해역에서 낚시로 어획하였다. 정액은 복부압박법을 이용하여 채취하였으며, 채정전 불순물이 섞이는 것을 방지하기 위해 사전에 배설물을 제거하였다. 채취한 정액은 냉동보존 실험전까지 빙냉상태로 유지하였다. 냉동실험에서 희석액으로 0.5 M glucose, 동해방지제로 dimethyl sulfoxide (DMSO), propylene glycol (PG), ethylene glycol (EG), glycerol (각각 5%, 10%, 15%, 20%)을 사용하였다. 평형시간은 3분으로 하였고, 그 후 액체질소증기 －76℃에서 3분간 완만냉동한 뒤, 액체질소(－196℃)에서 즉시 급속냉동하였다. 냉동정자의 활성과 운동지속시간을 비교하기 위해 20℃ 지하수에 급속 해동한 다음, 인공해수에 넣고 광학현미경으로 관찰하여 다음의 정자운동 평가표에 따라 운동활성을 비교하였다. 동해방지제별, 농도별 돗돔 정자의 SAI 및 운동지속시간은 PG 5%에서 각각 0, 0분, 10% 1, 1.6분, 15% 3, 5.0분, 20% 2, 3.1분이며, EG의 경우, 5% 0, 0분, 10% 1, 2.3분, 15% 2, 4.5분, 20% 3, 4.7분이었다. Glycerol에서는 5%, 0, 0분, 10% 0, 0분, 15% 3, 5.0분, 20% 4, 5.9분으로 나타났으며, DMSO에서는 5% 0, 0분, 10% 1, 1,7분, 15% 2, 3.0분, 20%에서 1, 1.8분으로 나타났다. Glycerol의 농도 15%, 20%일 때 SAI는 각각 3, 4로 모든 실험구에 비해 가장 높았다. 반면, DMSO에서는 glycerol에 비해 운동성 및 운동지속시간이 낮게 나타났는데, 그 이유는 DMSO의 독성으로 인해 운동성이 낮은 것으로 판단된다. 이는 동해방지제별 종 특이성에 의해 기인하는 것으로 생각되어지며, 돗돔 정자의 적정 동해방지제는 glycerol인 것으로 판단된다.

해양동물의 발생배 냉동보존에 관한 연구는 어류에서 그 결과가 미미한 반면, 패류에서는 Tiersch (2001)의 버지니아굴에 대한 유생 냉동보존을 비롯하여 Choi and Chang (2003)이 진주조개, Pinctada fucata martensii 발생배의 냉동보존 연구 등 대부분 조개류에 대하여 보고되었다. 한편, 고둥류에 대한 발생배 냉동보존 연구는 아직 초보 단계에 멈추어 있으며, 최근 Roux et al. (2008)에 의해 전복 발생배 냉동보존의 기초적인 지식이 얻어지기는 하였으나, 여전히 발생배를 냉동보존하는 데 있어 그 기초자료가 되는 여러 요인들에 관한 연구가 필요하다. 따라서 고둥류 발생배의 냉동보존 기술을 체계적으로 개발하기 위하여는 발생배의 냉동보존 시 초기발생 단계를 포함한 발생단계별 냉동효과, 침지실험에 의한 동해방지제, 평형시간 구명 및 최종적인 냉동보존 효과 파악을 위한 동해방지제별 활성영향, 적정농도 및 냉동실험이 체계적으로 이루어져야 한다. 이를 토대로, 본 연구에서는 고둥류 중 주요 산업종인 참전복, Haliotis discus hannai 발생배의 최적 냉동보존 조건을 파악하기 위하여 동해방지제 침지농도별 활성을 조사하였다. 완도산 참전복을 채란용 모패로 사용하였으며, 수온자극과 자외선조사해수자극을 병행한 산란유발 자극에 의해 수정란을 확보하였다. 동해방지제별, 농도별 침지에 따른 참전복 발생배에 미치는 활성을 파악하기 위해, 인공해수(NaCl 2.7 g, KCl 0.07 g, NaHCO3 0.05 g, CaCl2 0.12 g, MgCl2 0.46 g, Milli-Q water 100 ㎖)를 희석액으로 하고, 여기에 dimethyl sulfoxide (DMSO), ethylene glycol (EG), propylene glycol (PG)를 최종농도가 0.1, 0.5, 1.0, 2.0 M이 되도록 혼합한 다음, 발생배를 침지하였다. 30분 경과 시 발생배로부터 동해방지제를 깨끗이 제거한 후 10분 간격으로 1시간 동안 trochophore, veliger의 생사 여부 및 운동성을 관찰하였다. 이때 광학현미경(×100)의 한 시야에서 움직이는 유생을 다음의 유생운동 평가표에 따라 유생활성지수(larval activity index, LAI)를 산정하였으며, 모든 실험은 3반복으로 실시하였다. 참전복의 발생단계 중 유생의 섬모운동을 시작하는 단계인 trochophore, veliger를 사용하여 동해방지제별, 농도별 침지에 따른 발생배에 미치는 활성을 관찰한 결과, 각 유생의 LAI는 모든 동해방지제의 0.1 M 농도에서 높았으며, 농도가 높을수록 LAI가 낮아짐을 알 수 있었다. 동해방지제 침지농도에 따른 유생의 반응은 농도가 낮은 실험구에서 비대칭 나선운동이 멈추었으나, 농도가 높아질수록 섬모운동을 멈추고 움직이지 않는 채로 심장박동만 관찰되었다. Trochophore보다 veliger를 사용한 실험구에서 전체적으로 LAI가 높아 veliger를 사용한 실험구가 trochophore 실험구보다 동해방지제에 대한 내성이 강한 것으로 나타났다. 각각의 동해방지제 중에서 EG에 침지한 유생의 LAI가 다른 동해방지제보다 유의하게 높아, EG가 참전복 발생배의 활성에 영향을 덜 미치는 것으로 판단된다.

우리나라에서 진주양식의 대상패류인 진주조개 (Pinctada fucata martensii) 담륜자를 냉동보존하기 위하여 4가지 동해방지제를 사용하여 냉동실험을 실시하고, 적합한 동해방지제를 찾고자 하였다. 동해방지제인 dimethyl sulfoxide (DMSO), ethylene glycol, glycerol과 1, 2-propanediol을 희석액인 0.2 M sucrose에 각각 0.01, 0.1, 1.0과 2.0 M이 되도록 혼합한 다음, 10